水体中云芝-F21a蓝藻互作机制的初步研究
作者单位：安徽农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：陈晓琳;韩国民
授予年度：2015年
摘 要：蓝藻爆发不仅会使鱼类等水生生物窒息死亡,而且会分泌毒素,直接危害生物生存与人类健康。利用微生物控制水华与传统的物理化学方法相比,具有方法简单、不易引起污染等优点,已成为蓝藻水华治理研究的热点。目前,微生物控藻研究多集中于筛选具有优良特性的溶藻细菌、病毒、真菌,而利用这些微生物溶藻对水体的透明度和水生生态也有一定的影响。近几年发现的一种新型真菌控藻方法可以克服上述生物控藻剂的缺点,为水华蓝藻的防治以及快速去除水体藻毒素提供了一种新的途径。这种方法是利用真菌菌丝体将活体藻细胞包裹并将其完全分解,同时藻溶液也变得透明澄清,然而此种除藻方法机制尚不清楚。本论文利用高效除藻真菌云芝-F21a(Trametes versicolor F21a)为供试菌,通过扫描电镜观察不同时间段的真菌-蓝藻互作的细胞生物学作用过程;利用转录组测序寻找差异表达的基因并进行功能富集分析,并利用RT-PCR及酶活分析的方法对差异表达的基因,特别是分解酶相关基因进行验证;建立云芝-F21a遗传转化体系用于基因功能验证。主要结果如下:(1)利用扫描电镜观察了不同时间段的云芝-F21a菌丝膜与蓝藻共培养体系,观察到在共培养体系中,云芝真菌菌丝形成一种不甚紧密的腔体状结构,这种结构把一部分蓝藻细胞包裹在其中,随着时间的延长,蓝藻细胞变形,直至最后完全消失。(2)对培养0 h、1 h、6 h的真菌-蓝藻共培养体系样品进行真菌转录组测序,分别得到5986250、6290837、5833802个有效的clean reads,其中大约53%的clean reads可以回帖(mapping)到云芝参考基因组上。将mapping上的基因进行注释并进行基因差异分析,结果显示共培养1 h的样品与0 h的样品相比,云芝有1439条基因的表达量显著上调,1981条表达量显著下调;而共培养6 h的样品与0 h的样品相比,云芝有1161条基因的表达量显著上调,1887条下调。对共培养过程中差异表达的基因通过GO term富集分析可以看出:在生物学层面,这些差异表达的基因主要与细胞加工、代谢加工等相关;在细胞组分层面,这些差异表达的基因主要与细胞器组分、高分子复合物有关;在分子功能层面,这些差异表达的基因主要与结合、催化有关。通过KEGG Pathway富集分析可以看出,差异表达的基因主要与细胞加工、环境信息加工、遗传信息加工、代谢有关。在细胞加工层面,差异基因主要参与物质代谢运转、细胞生长和死亡;在环境信息加工层面,差异基因主要参与信号转导;在遗传信息加工层面,差异基因主要参与转录、翻译、化合物的折叠分选降解有关。特别是在代谢层面,差异表达的基因主要参与多糖的合成与代谢、脂类代谢、有害物质的生物降解、能量代谢、碳水化合物代谢、氨基酸代谢等。通过GO、KEGG富集分析可以推测,真菌云芝-F21a很可能是通过分解蓝藻细胞的各个组分,然后将各个组分的代谢产物转运到细胞中变成自己生长发育的原材料,云芝的分解酶类以及代谢酶类可能在该新型真菌杀藻过程中起重要作用。对共培养过程中上调的基因进行进一步CAZymes注释,结果显示这些上调的基因中许多是水解酶相关基因,如纤维素酶、木质素酶、锰过氧化物酶、漆酶、α/β水解酶等,这些水解酶相关基因中大约54%的水解酶含有分泌型导肽,意味着超过一半表达上调的分解酶可以分泌到真菌菌丝组成的腔体结构中。对这些水解酶基因进行半定量PCR验证表明,多数差异表达的分解酶基因的累积表达量与蓝藻的降解率呈正相关。主成分分析进一步显示,并不是所有的水解酶基因在真菌降解蓝藻过程中都发挥着相同的贡献,有的水解酶基因如:jgi|Trave1|126211(Cellobiohydrolase I)、jgi|Trave1|30530(GH13)、jgi|Trave1|60067(GH16)、jgi|Trave1|132063(GH18)、jgi|Trave1|58303(α-glucosidase)、jgi|Trave1|138531(laccase)、jgi|Trave1|135205(GH16)、jgi|Trave1|68611(GH72)、jgi|Trave1|131032|(GH5)等在降解蓝藻的过程中可能起主导作用,是主要的分解蓝藻的酶编码基因,酶活的初步分析结果与该分析结论基本一致。(3)云芝-F21a的原生质体制备再生最佳条件为:在PDA培养基上,28℃培养4 d的菌丝,以0.6 mol/L KCl为最佳稳渗剂,在混合酶液(2%cellulase+2%snailase+2%lywallzyme),30℃条件下酶解4 h。原生质体产量可达2.375×10～7个/mL,原生质体再生率达0.74%。采用限制性内切酶介导技术将质粒pAN7-1导入云芝F21a的原生质体获得经PCR验证的
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