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E75K突变对中心蛋白与Tb（Ⅲ）/Ca（Ⅱ）作用的影响

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山西大学学报(自然科学版) 2023年第4期46卷 897-902页

作者：赵亚琴刘旭荣山西大学分子科学研究所

中心蛋白(centrin)是高度保守EF-hand超家族成员，蛋白的N端结构域与C端结构域之间可能存在协同性，那么位于蛋白N端结构域的EF-hand结构基元丧失金属离子结合能力后是否会对蛋白C端结构域的金属离子结合特性产生影响？本文利用分子生... 详细信息

中心蛋白(centrin)是高度保守EF-hand超家族成员，蛋白的N端结构域与C端结构域之间可能存在协同性，那么位于蛋白N端结构域的EF-hand结构基元丧失金属离子结合能力后是否会对蛋白C端结构域的金属离子结合特性产生影响？本文利用分子生物学方法将八肋游仆虫中心蛋白(Euplotes octocarinatus centrin, EoCen)的75位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)得到EoCen-E75K，通过荧光光谱法、等温滴定量热法、远紫外圆二色光谱及紫外-可见吸收光谱等方法研究了EoCen-E75K与Tb3+/Ca2+的结合。结果表明，突变体蛋白EoCen-E75K与Tb3+/Ca2+的结合比为1∶3。参与金属离子配位的E突变为带相反电荷的K，改变蛋白质EF-hand结构域的静电平衡，使其丧失与金属离子的结合，Tb3+/Ca2+结合在蛋白EF-handⅠ、Ⅲ、Ⅳ位点。突变使得EoCen蛋白Ⅲ、Ⅳ位点与Tb3+的结合能力降低10～100倍。另外，E突变为K后EoCen的二级结构没有明显改变，疏水结构的外露程度减弱。

关键词：中心蛋白光谱 Tb3+/Ca2+ 离子结合

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游仆虫中心蛋白聚合特性的初步分析

山西大学学报(自然科学版) 2005年第2期28卷 117-119页

作者：梁爱华贺晓静杨斌盛山西大学生物技术研究所山西大学生物技术研究所山西太原030006

中心蛋白是一类对微管组织中心的复制、分裂及依赖于中心蛋白的纤维收缩方面起重要作用的蛋白质.为了研究中心蛋白可能的结构变化,纯化了重组的游仆虫中心蛋白,并利用分子排阻层析研究了它在体外的聚合及盐的影响.结果表明,盐浓度对聚... 详细信息

中心蛋白是一类对微管组织中心的复制、分裂及依赖于中心蛋白的纤维收缩方面起重要作用的蛋白质.为了研究中心蛋白可能的结构变化,纯化了重组的游仆虫中心蛋白,并利用分子排阻层析研究了它在体外的聚合及盐的影响.结果表明,盐浓度对聚合有很大的影响.高盐浓度时,蛋白以纤维状的单体形式存在;无盐时蛋白以纤维状的二聚或多聚体形式存在.

关键词：中心蛋白分子排阻层析聚合

Glu101对保持中心蛋白正常构象作用的研究——光谱法研究稀土离子与八肋游仆虫中心蛋白作用对蛋白构象的影响

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山西大学学报(自然科学版) 2007年第2期30卷 224-228页

作者：杨斌盛李国亭王志军赵亚琴段炼山西大学分子科学研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室

通过位点直接突变法将八肋游仆虫中心蛋白101位保守的Glu突变成Lys,得到突变蛋白E101K.利用疏水性探针TN S研究了突变对Tb3+与蛋白作用时蛋白构象变化的影响.结果表明,相对于钙饱和的蛋白,铽的饱和对蛋白构象变化的影响更大.同时,共振... 详细信息

通过位点直接突变法将八肋游仆虫中心蛋白101位保守的Glu突变成Lys,得到突变蛋白E101K.利用疏水性探针TN S研究了突变对Tb3+与蛋白作用时蛋白构象变化的影响.结果表明,相对于钙饱和的蛋白,铽的饱和对蛋白构象变化的影响更大.同时,共振光散射研究表明,Glu101对保持蛋白适当的构象变化行为起着至关重要的作用.

关键词：中心蛋白定点突变稀土离子荧光光谱

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八肋游仆虫中心蛋白的核磁共振研究

福州大学学报（自然科学版） 2012年第6期40卷 823-827页

作者：洪晶郭晨云刘华梁爱华林东海汪少芸福州大学生物科学与工程学院福建福州350108 厦门大学化学化工学院福建厦门361005 山西大学生物技术研究所山西太原030006

利用液体核磁共振方法对八肋游仆虫中心蛋白全长蛋白(EoCen),LC端结构域(EoCen-LC)和N端结构域(EoCen-N)进行了分析,并研究了蛋白与钙离子的相互作用情况.研究结果表明,未加入钙离子,全长蛋白,LC端结构域和N端结构域谱图重叠严重,峰型较... 详细信息

利用液体核磁共振方法对八肋游仆虫中心蛋白全长蛋白(EoCen),LC端结构域(EoCen-LC)和N端结构域(EoCen-N)进行了分析,并研究了蛋白与钙离子的相互作用情况.研究结果表明,未加入钙离子,全长蛋白,LC端结构域和N端结构域谱图重叠严重,峰型较差,说明未折叠成良好的三级结构,存在较大的构象交换或一定程度的聚集;与钙离子结合后全长蛋白,LC端结构域三级结构有所改善,但仍然无法用液体核磁共振方法进行进一步的结构研究.N端结构域与钙离子结合后谱峰分散性好,说明N端结构域具有较好的三级结构,能够应用核磁共振的方法进行结构解析.

关键词：八肋游仆虫中心蛋白核磁共振结构

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八肋游仆虫中心蛋白N-端半分子金属离子结合性质的光谱研究

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山西大学学报(自然科学版) 2009年第4期32卷 572-576页

作者：杨斌盛刘文任列香段炼赵亚琴王志军山西大学分子科学研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室

Ca2+在中心蛋白调节许多生理过程并发挥生物功能中起到很重要的作用.本文分别使用TNS、Tb3+为荧光探针研究了八肋游仆虫中心蛋白N-端半分子(P12)与不同稀土离子的结合性质及对其构象变化的影响和P12与Tb3+结合的热力学性质.结果表明,在p... 详细信息

Ca2+在中心蛋白调节许多生理过程并发挥生物功能中起到很重要的作用.本文分别使用TNS、Tb3+为荧光探针研究了八肋游仆虫中心蛋白N-端半分子(P12)与不同稀土离子的结合性质及对其构象变化的影响和P12与Tb3+结合的热力学性质.结果表明,在pH7.4、0.01mol/L Hepes条件下,中心蛋白与稀土离子结合的稳定性和稀土离子饱和的蛋白质疏水区暴露程度与稀土离子静电势成正比;稀土离子主要以静电作用占据八肋游仆虫中心蛋白N-端区域的金属离子结合部位.

关键词： Ln3+ 构象变化中心蛋白

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八肋游仆虫中心蛋白的聚集与磷酸化

八肋游仆虫中心蛋白的聚集与磷酸化

作者：刁秀玲山西大学

学位级别：硕士

信号和聚集是中心蛋白的两个主要功能。在生物体中,中心蛋白的可逆磷酸化调节着细胞内的信号转导过程,中心蛋白的聚集在很大程度上影响着系统的运动行为。本论文选用八肋游仆虫中心蛋白为对象研究了该中心蛋白的聚集和磷酸化关系。首先... 详细信息

信号和聚集是中心蛋白的两个主要功能。在生物体中,中心蛋白的可逆磷酸化调节着细胞内的信号转导过程,中心蛋白的聚集在很大程度上影响着系统的运动行为。本论文选用八肋游仆虫中心蛋白为对象研究了该中心蛋白的聚集和磷酸化关系。首先,对中心蛋白的聚集和磷酸化关系做了初步探索,共振光散射(RLS)实验表明磷酸化修饰的中心蛋白(EoCenp)能发生聚集,其聚集程度比野生型中心蛋白(EoCen)小,聚集程度均与蛋白质浓度呈正相关。31P-NMR实验表明中心蛋白聚集与否均可在磷酸化激酶(PKA)的催化下发生磷酸化作用。其次,研究了金属离子对磷酸化修饰的中心蛋白聚集的影响。RLS表明稀土离子Tb3+的结合是中心蛋白发生聚集的引发剂,结合不同当量的稀土离子,其聚集程度也不同。TNS荧光探针表明,疏水力是中心蛋白聚集的主要作用力。与EoCen相比,EoCenp结合饱和稀土离子Tb3+后,聚集速率减慢,聚集程度降低。中心蛋白聚集是以N-N, C-C肩并肩形式发生的。荧光寿命测定表明聚集引起中心蛋白的构象或Tyr环境的改变,从而导致中心蛋白寿命的降低。最后,研究了离子强度和温度对磷酸化修饰的中心蛋白聚集的影响。离子强度的增加抑制EoCen的聚集,磷酸化修饰后,EoCenp聚集受到离子强度的抑制作用减小。温度升高促进EoCen的聚集,磷酸化修饰后,EoCenp聚集受到温度的促进作用减小。

关键词：中心蛋白磷酸化聚集金属离子共振光散射

八肋游仆虫中心蛋白的表达、纯化及光谱性质研究

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八肋游仆虫中心蛋白的表达、纯化及光谱性质研究

作者：丰九英山西大学

学位级别：硕士

中心蛋白(Centrins)是真核细胞中一种重要的蛋白质，与细胞中纤维的收缩、细胞的分裂等密切相关。目前，中心蛋白结构与功能的研究依然是细胞生物学研究的热点之一，但国内外关于Centrins的研究多集中在生物功能上，仍没有晶体结构的报... 详细信息

中心蛋白(Centrins)是真核细胞中一种重要的蛋白质，与细胞中纤维的收缩、细胞的分裂等密切相关。目前，中心蛋白结构与功能的研究依然是细胞生物学研究的热点之一，但国内外关于Centrins的研究多集中在生物功能上，仍没有晶体结构的报道，从溶液结构入手进行结构与功能关系的探讨也很少。近年来稀土资源的不断开发利用增加了稀土元素进入生命体的途径和机会，这使得稀土元素在生命体中的代谢模式受到普遍重视。Centrins是钙结合蛋白家族的成员，含有四个EF-hand结构域，每个结构域可能结合一个Ca，所以它可能是稀土离子在生物体内实现其生物效应的载体。目前国内外尚无关于单细胞低等真核生物-游仆虫中心蛋白基因表达、溶液构象和生物功能等方面的研究报道。本研究利用聚合酶链式反应(PCR)技术和基因重组技术构建了八肋游仆虫中心蛋白基因centrin的重组表达质粒pGEX-6p-1-centrin，并将其转入大肠杆菌(***)BL21中用IPTG诱导，获得centrin的可溶性融合表达。融合蛋白GST-Centrin菌体裂解液上清经GST亲和层析后用PreScission Protease(PPase)酶切，酶切产物再经GST亲和层析和Hitrap Q阴离子交换层析两步柱层析纯化后，得到纯度较好(90％以上)的Centrin。纯化后的Centrin先运用GenePro对它的一些参数及性质做了预测，诸如等电点、净电荷量、亲水亲脂性、α-螺旋分布及钙结合区氨基酸序列分布等，以期为后续实验研究起到理论性的指导作用。预测分析表明：中心蛋白是一个酸性(pI 6.5)、小分子量(19664Da)、水溶性(Hydrophobic 26.2％)蛋白，它含有四个EF-hand型结构域，每个结构域可能结合一个钙离子，但N-端区和C-端区的钙结合能力可能有差别。然后通过紫外光谱和荧光光谱的方法探讨了它与金属离子(Ca、Tb)及小肽(Melittin)的相互作用。实验结果表明：Ca、Tb与apoCentrin结合时在蛋白上的作用位点为同一位点，而且键合顺序也相同，即均优先占据蛋白C-端区的第Ⅲ和第Ⅳ位：在与金属离子结合时蛋白四个钙结合位点中的天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)残基侧链参与了金属离子的配位：Tb能竞争Ca的结合位点，并且能完全占据钙结合位点，Ca的存在并不影响Tb在Centrin上的结合顺序;Melittin与Centrin的相互作用后形成1:1的复合物，它们之间的相互作用不依赖于Ca，两者结合后Centrin的溶液结构可能由原来的哑铃形变为球形;Tb与apoCentrin的结合并不影响蛋白与Melittin相互作用，但Melittin与apoCentrin相互作用导致Tb不能与蛋白结合：Melittin与Centrin作用时，Ca的存在使得Tb能与Centrin结合但不能完全占据它的四个结合位点。

关键词：中心蛋白基因表达基因重组八肋游仆虫光谱性质

定点突变对八肋游仆虫中心蛋白功能及性质的影响

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定点突变对八肋游仆虫中心蛋白功能及性质的影响

作者：赵亚琴山西大学

学位级别：硕士

中心蛋白是一广泛存在于多种生物体内的蛋白，它属于结合钙离子的EF-hand超家族成员。最初，它是在一种绿藻Chlamydomonas reinhardtii中发现的。而且相关研究表明它主要定位在微管组织中心上，是微管组织进行正常的复制、分裂的一种必... 详细信息

中心蛋白是一广泛存在于多种生物体内的蛋白，它属于结合钙离子的EF-hand超家族成员。最初，它是在一种绿藻Chlamydomonas reinhardtii中发现的。而且相关研究表明它主要定位在微管组织中心上，是微管组织进行正常的复制、分裂的一种必需成分。中心蛋白的结构类似于钙调蛋白、肌钙蛋白C的结构，含有四个EF-hand(helix-loop-helix)结构，即四个钙结合位点。随着生物技术的逐步成熟，定点突变成为了科研人员进行科学研究的有力手段。本文利用生物技术对八肋游仆虫中心蛋白进行了定点突变，获得较纯的蛋白，并且应用光谱手段研究了其部分性质。利用聚合酶链式反应(PCR)技术和基因重组技术对八肋游仆虫中心蛋白的451位的苷氨酸进行了定点突变，获得了其重组质粒M-pGEX-6P-M-Centrin，并将其转入大肠杆菌(***)BL21中用IPTG诱导，获得了M-Centrin的可溶性融合表达。融合蛋白GST- M-Centrin菌体经过超声波裂解后得到的上清夜经过GST亲和层析后用PreScission Protease(PPase)酶切，酶切产物再次经过GST亲和层析和HitrapQ阴离子交换层析两步柱层析纯化后，得到纯度较高的的M-Centrin。利用紫外光谱和荧光光谱的方法探讨了中心蛋白突变体和金属离子及蜂毒素之间的相互作用。实验表明：从紫外吸收图谱看，突变之后的中心蛋白中除了苯丙氨酸的精细结构外还有酪氨酸和色氨酸的吸收峰。蛋白的最大荧光发射峰从310nm红移至360nm。Tb和中心蛋白结合优先占据第Ⅲ、Ⅳ位点，形成2：1的稳定配合物。而且，我们从中求得了Tb和中心蛋白配合物的条件稳定常数。Tb、Ca不会影响蜂毒素与中心蛋白的结合。

关键词：中心蛋白微管组织聚合酶链式反应基因重组八肋游仆虫定点突变

Glu101在八肋游仆虫中心蛋白构象及生物功能发挥中的作用

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Glu101在八肋游仆虫中心蛋白构象及生物功能发挥中的作用

作者：李国亭山西大学

学位级别：硕士

中心蛋白(centrin)分子量约为20 kDa，属于钙调蛋白超族，含有四个保守的EF-手结构域(helix-loop-helix)，每个结构域可结合一个钙离子。它定位于中心体及细胞核、膜间空间等部位，在中心粒的复制和中心基体纤维的收缩中发挥重要作用。... 详细信息

中心蛋白(centrin)分子量约为20 kDa，属于钙调蛋白超族，含有四个保守的EF-手结构域(helix-loop-helix)，每个结构域可结合一个钙离子。它定位于中心体及细胞核、膜间空间等部位，在中心粒的复制和中心基体纤维的收缩中发挥重要作用。突变氨基酸的研究方法被广泛用来考察蛋白中某些重要氨基酸在蛋白构象及生物功能发挥中的作用。其中紫外照射突变法的优点是可以得到大量突变型蛋白，为研究工作提供较多的实验样本。但其突变结果具有不可知性，需要进行系列的筛选工作。定点突变法以其明确的突变位点以及能够得到高纯度突变蛋白等优点而在许多研究工作中被采用。基于对150多种钙调蛋白超族成员序列的分析，E-helix链的规范序列可以表示为Ennnn。其中，E表示Glu，n表示疏水性氨基酸，$表示任意氨基酸。根据达尔文生物进化理论，我们推测E-helix链起始的Glu可能对centrin的正常构象和功能的发挥起着重要作用。本文用分子生物学的方法表达、纯化得到了纯度较高的八肋游仆虫中心蛋白(EoCen)，利用定点突变法将EoCen中第三个EF-手E-helix的第一个氨基酸——Glu101突变为Lys，得到突变蛋白E101K。并从以下几方面研究了保守的Glu101对蛋白构象及生物功能发挥的作用。首先，采用荧光光谱法、紫外-可见分光光度法考察了Glu101的突变对蛋白基本光谱的影响。结果表明保守的Glu101的突变对蛋白的激发、发射光谱和吸收光谱均不产生影响。此外，以Tb为荧光探针考察了突变对蛋白金属结合性质的影响。结果表明Glu101的突变大大增强了Tb与蛋白第三个EF-手结合位点作用的荧光敏化强度，推测是由于突变使蛋白构象发生变化而导致蛋白该结合位点与Tb作用时的荧光敏化增强。说明Glu101对保持蛋白正常的金属结合性质发挥着重要作用。其次，研究了Glu101的突变对蛋白与稀土离子作用的影响。结果表明稀土离子与蛋白作用时蛋白构象的变化程度远大于钙离子与蛋白的作用。此外，与EoCen相比，Glu101的突变明显增强了E101K与稀土离子作用时的共振光散射强度，说明Glu101对保持蛋白与稀土离子作用时正常的构象变化起重要作用。最后，考察了Glu101的突变对蛋白与蜂毒素作用的影响。结果表明蛋白与蜂毒素作用时形成1：1复合物，且Glu101的突变对蛋白与蜂毒素的作用影响较小。

关键词：中心蛋白定点突变荧光光谱稀土离子蜂毒素