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中国棉铃虫核型多角体病毒的感染对宿主细胞周期和细胞周期蛋白的影响

中国棉铃虫核型多角体病毒的感染对宿主细胞周期和细胞周期蛋白的...

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作者：周蕊华中师范大学

学位级别：硕士

病毒一方面改变宿主细胞以满足自身复制的需要：而另一方面，宿主细胞面临病毒复制带来的压力也会改变自身的机制来保护自己。许多病毒的感染会导致宿主细胞周期的阻滞，如细小病毒、疱疹病毒、逆转录病毒等等。但是在杆状病毒的研究领... 详细信息

病毒一方面改变宿主细胞以满足自身复制的需要：而另一方面，宿主细胞面临病毒复制带来的压力也会改变自身的机制来保护自己。许多病毒的感染会导致宿主细胞周期的阻滞，如细小病毒、疱疹病毒、逆转录病毒等等。但是在杆状病毒的研究领域，有关杆状病毒与宿主细胞周期相互关系的研究较少。我们以HaSNPV—Hz细胞为实验系统，研究杆状病毒的感染对昆虫细胞周期进程和周期蛋白的影响。实验结果如下： 1．正常Hz细胞周期各个时相的分布和时间间隔通过FACS分析不同步的正常Hz细胞，发现47-53％的细胞处于G期;20-27％的细胞处于S期;33-20％的细胞处于G/M期;并且没有异倍体(＞4N DNA)细胞的出现。羟基脲可以将Hz细胞抑制于细胞周期的G期。加入终浓度为60ug/ml的羟基脲作用24hr后，74％的Hz细胞被抑制于细胞周期的G期。通过细胞周期抑制剂抑制并释放细胞来测定细胞周期各时相之间的时间间隔，FACS分析发现Hz细胞完成整个细胞周期时间大概为40hr;G期到S期的时间为10hr;S期到G/M期的时间为14hr;G/M期到G期的时间为16hr。 ***的感染对Hz细胞周期进程的影响 HaSNPV感染不同步的Hz细胞，病毒感染后的8hr，处于G/M期的细胞数量开始增加，有44％的细胞被抑制在G/M期，这种对细胞周期的抑制完成于HaSNPV感染后24hr左右，抑制于G/M期达到70％左右。FACS分析发现HaSNPV感染24hr后，出现了14.3％的异倍体(＞4N DNA)细胞;当HaSNPV感染72hr时，异倍体(＞4N DNA)细胞的数量达到最大值，并且细胞的异倍体化现象随着感染时间延长越趋明显。用HaSNPV感染同步于G期的Hz细胞，同样发现HaSNPV感染可以将细胞抑制于G/M期。／左白八硕士学位论文＼枯宗不y NIu＊ER’S TI IFSIS ***白感染对Hi 全胞周期蛋白的影晌 HaSNPV感染不同步的k细胞，CyclinB;表达量在病毒感染后的16hr开始升高，在感染后的24hr达到高峰。用HaSNPV感染同步于G;期的k细胞，同样发现HaSNPV感染导致CyclinB;表达量升高。通过共聚焦激光扫描显微镜对正常k细胞和 HaSNPV感染 48hr后细胞中的 CyclinB;进行了定位，发现在正常的k细胞中 Cycl niB;在细胞核和细胞质中都有分布，而在 HaSNPV感染 48hr的k细胞中CyclinB大部分都存在于细胞质中，说明HaSNPV感染极有可能是将细胞抑制于细胞周期的G。期。我们还发现HaSNPV的感染对k细胞对CyclinA的表达水平基本没有影响。

关键词：中国棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒流式细胞分析细胞周期细胞周期蛋白

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基于杆状病毒F蛋白的真核表面展示系统的构建

基于杆状病毒F蛋白的真核表面展示系统的构建

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作者：毛海涛华中师范大学

学位级别：硕士

表面展示技术为生物大分子的设计以及分析它们之间的相互作用提供了有力的工具。近十几年来,噬菌体表面展示已被应用分子生物学的各个领域并极大的促进了生物学的研究进展。但是作为一种原核表达系统,在糖基化,复杂蛋白质的折叠方面,噬... 详细信息

表面展示技术为生物大分子的设计以及分析它们之间的相互作用提供了有力的工具。近十几年来,噬菌体表面展示已被应用分子生物学的各个领域并极大的促进了生物学的研究进展。但是作为一种原核表达系统,在糖基化,复杂蛋白质的折叠方面,噬菌体表面展示技术显示出一定的局限性。真核展示使得复杂糖基化蛋白的表达成为可能。自从1995年Boublik等以苜蓿银纹夜蛾多核衣壳核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)成功展示外源蛋白以来,已经有多个实验室利用该系统展示了一系列原核系统难以展示的蛋白。通常是将外源蛋白融合到AcMNPV的主要膜蛋白Gp64的N末端。该技术在产生和筛选真核表达文库以及生产单克隆抗体中的潜在应用价值已经得到验证。杆状病毒的出芽型病毒粒子(budded virions,BV)有两类截然不同的膜融合蛋白。Gp64是组Ⅰ类NPV BV上的主要膜融合蛋白,它在低pH的条件下介导膜融合;并且Gp64对于病毒粒子从被感染细胞中的出芽是必需的。另一类不同的膜蛋白由组Ⅱ类NPV编码,被称为F蛋白。组Ⅱ类NPV包括甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua MNPV,SeMNPV),舞毒夜蛾核多角体病毒(Lymantria disper MNPV,LdMNPV),中国棉铃虫核多角体病毒(Helicoverpa armigera SNPV,HaSNPV)等。作为Gp64的同源蛋白,F蛋白同样在病毒进入细胞的过程中介导酸性条件下的膜融合。但是F蛋白在获得膜融合活性并使病毒粒子有感染性之前,必需要被细胞内的furin蛋白酶切割成两个二硫键连接的小亚基。到目前为止,基于AcMNPV和基于BmNPV(Bombyx mori NPV)的杆状病毒表面展示系统已经开发出来。但它们都是属于组Ⅰ类NPV,组Ⅱ类NPV的表面展示还没有人研究。在本文中,我们将报告另一类基于HaSNPV的F蛋白的真核展示系统得构建。 HaSNPV是棉铃虫的主要致病病毒,所以在中国主要用于生物防治杀虫剂。像其他的组Ⅱ类NPV一样,HaSNPV的基因中没有Gp64样的基因,但是发现ORF133与f基因同源,经研究证实ha133编码F蛋白。F蛋白经过翻译后修饰被切割成两个由二硫键连接的小亚基,一个是跨膜结构域所在的F1片段,大小59kd,另一个是20kd的F2片段。由于F蛋白介导病毒粒子进入细胞的过程并能影响病毒粒子出芽的效率,因而在病毒的复制周期中是必需的,它的缺失也是致死的,所以我们在HaSNPV基因组的polh基因座处引入F蛋白的第二个基因拷贝。作为组Ⅱ类的杆

关键词：中国棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒 Ha133蛋白 F蛋白表面展示

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