基于杆状病毒F蛋白的真核表面展示系统的构建

作     者：毛海涛 

作者单位：华中师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：彭建新;陈新文

授予年度：2006年

学科分类：0710[理学-生物学] 090403[农学-农药学(可授农学、理学学位）] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 0904[农学-植物保护] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：中国棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒 Ha133蛋白 F蛋白 表面展示 

摘      要：表面展示技术为生物大分子的设计以及分析它们之间的相互作用提供了有力的工具。近十几年来,噬菌体表面展示已被应用分子生物学的各个领域并极大的促进了生物学的研究进展。但是作为一种原核表达系统,在糖基化,复杂蛋白质的折叠方面,噬菌体表面展示技术显示出一定的局限性。真核展示使得复杂糖基化蛋白的表达成为可能。自从1995年Boublik等以苜蓿银纹夜蛾多核衣壳核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)成功展示外源蛋白以来,已经有多个实验室利用该系统展示了一系列原核系统难以展示的蛋白。通常是将外源蛋白融合到AcMNPV的主要膜蛋白Gp64的N末端。该技术在产生和筛选真核表达文库以及生产单克隆抗体中的潜在应用价值已经得到验证。 杆状病毒的出芽型病毒粒子(budded virions,BV)有两类截然不同的膜融合蛋白。Gp64是组Ⅰ类NPV BV上的主要膜融合蛋白,它在低pH的条件下介导膜融合;并且Gp64对于病毒粒子从被感染细胞中的出芽是必需的。另一类不同的膜蛋白由组Ⅱ类NPV编码,被称为F蛋白。组Ⅱ类NPV包括甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua MNPV,SeMNPV),舞毒夜蛾核多角体病毒(Lymantria disper MNPV,LdMNPV),中国棉铃虫核多角体病毒(Helicoverpa armigera SNPV,HaSNPV)等。作为Gp64的同源蛋白,F蛋白同样在病毒进入细胞的过程中介导酸性条件下的膜融合。但是F蛋白在获得膜融合活性并使病毒粒子有感染性之前,必需要被细胞内的furin蛋白酶切割成两个二硫键连接的小亚基。到目前为止,基于AcMNPV和基于BmNPV(Bombyx mori NPV)的杆状病毒表面展示系统已经开发出来。但它们都是属于组Ⅰ类NPV,组Ⅱ类NPV的表面展示还没有人研究。在本文中,我们将报告另一类基于HaSNPV的F蛋白的真核展示系统得构建。 HaSNPV是棉铃虫的主要致病病毒,所以在中国主要用于生物防治杀虫剂。像其他的组Ⅱ类NPV一样,HaSNPV的基因中没有Gp64样的基因,但是发现ORF133与f基因同源,经研究证实ha133编码F蛋白。F蛋白经过翻译后修饰被切割成两个由二硫键连接的小亚基,一个是跨膜结构域所在的F1片段,大小59kd,另一个是20kd的F2片段。由于F蛋白介导病毒粒子进入细胞的过程并能影响病毒粒子出芽的效率,因而在病毒的复制周期中是必需的,它的缺失也是致死的,所以我们在HaSNPV基因组的polh基因座处引入F蛋白的第二个基因拷贝。作为组Ⅱ类的杆