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miR-324-3p靶向AKT1调控乳腺癌细胞放射增敏性的机制研究

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中国临床研究 2020年第7期33卷 879-883,889页

作者：张亚珍宋杰峰吴煌福黄光钺海南医学院第二附属医院肿瘤外科海南海口570311 海南医学院第二附属医院放射科海南海口570311

目的研究微小核糖核酸(miR)-324-3p对体外培养的乳腺癌MCF-7细胞放射敏感性的影响并探讨其作用机制。方法采用qRT-PCR法和Western blot法分别检测miR-324-3p、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)1蛋白的表达量;采用LipofectamineTM2000介导,将... 详细信息

目的研究微小核糖核酸(miR)-324-3p对体外培养的乳腺癌MCF-7细胞放射敏感性的影响并探讨其作用机制。方法采用qRT-PCR法和Western blot法分别检测miR-324-3p、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)1蛋白的表达量;采用LipofectamineTM2000介导,将过表达miR-324-3p模拟物、沉默和过表达AKT1质粒转染乳腺癌MCF-7细胞并联合4 Gy放射照射,应用克隆形成实验、CCK-8试剂盒、流式细胞术法检测细胞存活率、细胞活性、细胞凋亡率,并绘制单击多靶模型拟合曲线;利用TargetScan在线预测、荧光素酶基因报告试验及Western blot法验证miR-324-3p的靶向关系。结果与正常乳腺上皮细胞MCF10A相比,乳腺癌MDA-MB-435S、MCF-7细胞中miR-324-3p的表达下调,AKT1蛋白表达上调(P均<0.05)。过表达miR-324-3p联合放射照射,MCF-7细胞放射敏感性增加,存活率呈剂量依赖性降低,细胞活性降低、凋亡率升高(P均<0.05)。miR-324-3p靶向调控AKT1的表达,当沉默AKT1联合放射照射时,MCF-7细胞放射敏感性增加,存活率下降并呈剂量依赖性,细胞活性降低、凋亡率升高(P均<0.05)。过表达AKT1逆转了miR-324-3p对乳腺癌放射敏感性、细胞增殖及凋亡的作用。结论过表达miR-324-3p可以靶向调控AKT1的表达,增强乳腺癌MCF-7细胞的放射敏感性。

关键词：微小核糖核酸-324-3p 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1 乳腺癌放射增敏细胞增殖细胞凋亡

长链非编码RNA LINC00662/微小RNA-16-5p/wee1信号通路对肝细胞癌细胞增殖及凋亡的作用研究

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安徽医药 2023年第4期27卷 790-796页

作者：万焱罗煜王洁汤晓青郭玺徐斌昆明市第三人民医院肿瘤科云南昆明650000

目的探讨长链非编码RNA linc00662(LncRNA linc00662)通过微小RNA-16-5p(miR-16-5p)[/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(wee1)]信号轴在肝细胞癌(HCC)细胞增殖及凋亡中的作用。方法该研究时间为2019年8月至2020年10月,体外培养正常肝细胞株LO2和... 详细信息

目的探讨长链非编码RNA linc00662(LncRNA linc00662)通过微小RNA-16-5p(miR-16-5p)[/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(wee1)]信号轴在肝细胞癌(HCC)细胞增殖及凋亡中的作用。方法该研究时间为2019年8月至2020年10月,体外培养正常肝细胞株LO2和肝癌细胞株SK-HEP-1、HepG2、Huh-7和Li-7。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中linc00662、miR-16-5p和wee1的表达。以HepG2细胞作为研究对象,设置shRNA阴性对照(sh-NC)组、linc00662-shRNA干扰(sh-linc00662)组、抑制剂阴性对照(inhibitor-NC)组、miR-16-5p抑制剂(miR-16-5p inhibitor)组、siRNA阴性对照(si-NC)组、wee1-siRNA干扰(siwee1)组、linc00662-shRNA干扰联合miR-16-5p抑制剂(sh-linc00662+miR-16-5p inhibitor)组和miR-16-5p抑制剂联合wee1-siRNA干扰(miR-16-5p inhibitor+si-wee1)组。CCK-8和克隆形成实验检测细胞增殖活性;流式细胞仪检测细胞凋亡水平;蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白[B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bax)]表达。双萤光素酶报告基因实验检测linc00662、miR-16-5p和wee1之间的相关性。结果PCR结果显示相比较LO2细胞,linc00662在SK-HEP-1、HepG2、Huh-7和Li-7细胞中普遍高表达[0.95±0.14比2.12±0.17、3.86±0.15、2.31±0.14、1.82±0.18,P<0.001]。与sh-NC组相比,敲低linc00662能抑制肝癌细胞增殖(P<0.001)并诱导细胞凋亡(P<0.001)。双萤光素酶报告结果显示linc00662直接靶向结合miR-16-5p并负调控miR-16-5p的表达。同时,miR-16-5p直接靶向结合wee1并负调控wee1的表达。下调miR-16-5p表达可以减轻敲低linc00662对肝癌细胞生长的抑制作用。此外,linc00662可能通过miR-16-5p/wee1通路发挥促癌作用。结论Linc00662是一种在肝癌细胞中上调的LncRNA,可以通过miR-16-5p/wee1轴促进肝癌细胞增殖并抑制细胞凋亡。

关键词：癌,肝细胞丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1 微小RNA-16-5p lncRNA linc00662 增殖凋亡

miR-431-5p通过调控AKT1抑制胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和促进凋亡研究

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蚌埠医学院学报 2022年第6期47卷 716-721页

作者：汪俊州王义刚孙雅轩四川省攀枝花市中心医院肝胆外科 617067

目的:研究miR-431-5p对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响和潜在的分子机制。方法:qRT-PCR检测人正常胰腺上皮细胞hTERT-HPNE和胰腺癌细胞CFPAC-1和PANC-1中miR-431-5p表达水平。转染miR-431-5p模拟物至胰腺癌CFPAC-1细胞中过表达... 详细信息

目的:研究miR-431-5p对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响和潜在的分子机制。方法:qRT-PCR检测人正常胰腺上皮细胞hTERT-HPNE和胰腺癌细胞CFPAC-1和PANC-1中miR-431-5p表达水平。转染miR-431-5p模拟物至胰腺癌CFPAC-1细胞中过表达miR-431-5p后,MTT法测定细胞增殖活性,Transwell检测细胞迁移和侵袭,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting检测细胞中Cyclin D1、p21、Bax、Bcl-2、E-cadherin、MMP-2和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-431-5p与AKT1的调控关系。结果:与hTERT-HPNE细胞相比,胰腺癌细胞PANC-1和CFPAC-1中miR-431-5p表达量降低(P蛋白表达水平降低,p21、Bax和E-cadherin蛋白表达水平升高,差异均有统计学意义(P蛋白表达水平升高,p21、Bax和E-cadherin蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-431-5p通过靶向抑制AKT1降低胰腺癌CFPAC-1细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并促进细胞凋亡,可能是胰腺癌的潜在分子治疗靶点。

关键词：胰腺肿瘤 miR-431-5p 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1

茯苓提取物以miR-649/Akt1通路调控AngⅡ诱导血管平滑肌细胞的增殖、迁移和侵袭机制

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河北医药 2021年第5期43卷 655-660页

作者：姚卫黄伟张斌湖北省宜昌市第二人民医院重症医学科 443000

目的探讨茯苓提取物对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法AngⅡ诱导VSMCs细胞,茯苓提取物作用后,四甲基噻唑蓝染色法(MTT)检测细胞增殖,Transwell检测细胞的迁移和侵袭能力,Western... 详细信息

目的探讨茯苓提取物对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法AngⅡ诱导VSMCs细胞,茯苓提取物作用后,四甲基噻唑蓝染色法(MTT)检测细胞增殖,Transwell检测细胞的迁移和侵袭能力,Western Blot检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、上皮性钙粘附蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(Akt1)和磷酸化的Akt1(p-Akt1)蛋白表达,实时荧光定量PCR检测miR-649表达。转染miR-649模拟物至VSMCs细胞,上述方法检测miR-649过表达对AngⅡ诱导VSMCs细胞增殖、迁移和侵袭及相关蛋白表达的影响。双荧光素酶报告基因实验验证miR-649与Akt1靶向关系。结果AngⅡ诱导可促进VSMCs细胞增殖、迁移和侵袭,Cyclin D1和MMP-2蛋白、miR-649表达(P1、E-cadherin、Akt1和p-Akt1蛋白表达(P1和MMP-2蛋白、miR-649表达(P1、E-cadherin、Akt1和p-Akt1蛋白表达(P1和MMP-2蛋白表达(P1和E-cadherin蛋白表达(P1表达,抑制miR-649表达逆转了茯苓提取物对AngⅡ诱导的VSMCs细胞增殖、迁移和侵袭及相关蛋白Cyclin D1、P21、E-cadherin、MMP-2和Akt1、p-Akt1蛋白表达的影响。结论茯苓提取物可抑制AngⅡ诱导的VSMCs的增殖、迁移和侵袭,其可能通过调控miR-649/Akt1发挥作用。

关键词：茯苓提取物血管紧张素Ⅱ 血管平滑肌细胞 miR-649 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1 增殖迁移侵袭

双荧光素酶报告基因检测miR-185与AKT1靶标关系

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双荧光素酶报告基因检测miR-185与AKT1靶标关系

作者：曹大龙蚌埠医学院

学位级别：硕士

【目的】本课题小组前期实验研究发现,在A549,NCI-H1975,NCI-H1650和LTEP-a-2四种非小细胞肺癌细胞株中mi R-185表达明显下调,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(Serine/threonine Protein Kinase 1,AKT1)表达明显升高,二者表达呈负相关关系,提示m... 详细信息

【目的】本课题小组前期实验研究发现,在A549,NCI-H1975,NCI-H1650和LTEP-a-2四种非小细胞肺癌细胞株中mi R-185表达明显下调,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(Serine/threonine Protein Kinase 1,AKT1)表达明显升高,二者表达呈负相关关系,提示mi R-185对AKT1具有调控作用,AKT1可能是mi R-185的潜在靶基因,但不能确定二者直接相关。为了研究mi R-185与AKT1之间靶标关系,本实验构建克隆有目的基因片段的双荧光素酶报告基因载体,利用双荧光素酶报告基因检测系统验证二者相互关系。为后续进一步探讨mi R-185和AKT1基因在肺癌发生、发展过程中可能机制提供实验基础。【方法】利用生物信息学软件,预测mi R-185调控AKT1基因结合序列,设计合成AKT13’-UTR序列及突变后AKT13’-UTR序列,将合成的两种目的基因片段,分别克隆到pmir GLO双荧光素酶报告基因载体,构建AKT13’-UTR双荧光素酶报告基因野生型载体(pmir GLO-AKT1)及其突变型载体(pmir GLO-mut-AKT1)。重组载体经PCR电泳和基因测序鉴定,以证明重组载体构建成功。使用转染试剂lipofectamine TM 2000分别将这两种重组载体质粒与mi R-185模拟物(mimics)或mi R-185阴性对照(Negative Control,NC)共转染293T细胞,并利用双荧光素酶检测系统检测其活性。双荧光素酶报告基因载体中含有能在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶基因,一个是萤火虫荧光素酶报告基因,另一个是海肾荧光素酶报告基因。萤火虫荧光素酶报告基因为主要报告基因,目的基因片段被克隆至萤火虫荧光素酶报告基因下游的多克隆位点上(Mμltiple cloning site,MCS)。若目的基因表达被抑制,则使萤火虫荧光素酶转录过程受阻,抑制萤火虫荧光素酶蛋白翻译,萤火虫荧光值下降,而作为标准化内参照的海肾荧光素酶的表达不受影响,此时萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性值下降,从而可以确定mi RNA与靶基因是否具有直接调控作用。【结果】PCR电泳及基因测序结果显示,PCR扩增得到的含有AKT1 3’-UTR和突变后AKT1 3’-UTR序列的目的片段大小及序列与Gene Bank报道序列一致,且插入方向正确。因此,成功构建含有mi R-185结合位点的和其突变位点的两种重组质粒。双荧光素酶报告基因检测系统结果显示,转染克隆有AKT1 3’-UTR突变型载体质粒实验中,mi R-185组与阴性对照组比较,荧光素酶的活性值差异无显著性(F=2.29,P>0.05);转染克隆有AKT1 3’-UTR载体质粒实验中,mi R-185组荧光素酶活性明显受到抑制,与阴性对照组比较,荧光素酶的活性差异有显著性(F=80.39,P<0.05)。【结论】成功构建AKT1基因3’-UTR双荧光素酶报告基因载体及其突变型载体;AKT1基因是mi R-185直接作用的靶基因,且mi R-185结合于AKT1基因的3’-UTR区域,在转录后水平对AKT1基因有直接抑制作用。

关键词：微小RNA-185 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1 pmirGLO载体 3’-端非编码区双荧光素酶报告基因检测系统

纺锤体检验点蛋白在卵母细胞减数分裂过程中的研究进展

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中国当代医药 2021年第28期28卷 29-32页

作者：张越孙洪亮王成祥种海玲李清春滨州医学院附属医院生殖医学科山东滨州256600

纺锤体组装检验点蛋白在卵母细胞减数分裂中发挥着重要作用。它可以看作是一个高保真的监控染色体准确分离的系统,延缓分裂中期向后期的转变,直到所有的染色体准确排列到赤道板上。而在纺锤体组装检验点研究中,最重要的是各个纺锤体检... 详细信息

纺锤体组装检验点蛋白在卵母细胞减数分裂中发挥着重要作用。它可以看作是一个高保真的监控染色体准确分离的系统,延缓分裂中期向后期的转变,直到所有的染色体准确排列到赤道板上。而在纺锤体组装检验点研究中,最重要的是各个纺锤体检验点蛋白对减数分裂的调控机制。如果纺锤体检验点蛋白异常或发生突变,可能会产生染色体数目或形态不正常的细胞。本文对参与减数分裂过程中重要的纺锤体检验点蛋白的定位及功能进行综述。

关键词：纺锤体检验点蛋白激酶B 纺锤体检验点蛋白E 有丝分裂阻滞缺陷蛋白1 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1