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重组大肠杆菌的高密度培养及在丙谷二肽生产中的应用

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食品与发酵工业 2020年第13期46卷 30-35页

作者：裴绪泽李益民杜聪袁文杰大连理工大学生物工程学院辽宁大连116024

以表达α-酯酰基转移酶的重组大肠杆菌作为全细胞催化剂,连接丙氨酸甲酯盐酸盐与谷氨酰胺合成丙谷二肽,是目前生产丙谷二肽最理想的方法。利用高密度发酵法,能提高微生物的生产量,降低二肽生产成本。首先,在摇瓶水平下,利用响应面模型... 详细信息

以表达α-酯酰基转移酶的重组大肠杆菌作为全细胞催化剂,连接丙氨酸甲酯盐酸盐与谷氨酰胺合成丙谷二肽,是目前生产丙谷二肽最理想的方法。利用高密度发酵法,能提高微生物的生产量,降低二肽生产成本。首先,在摇瓶水平下,利用响应面模型对于基础培养基碳源、氮源、无机盐等因素进行研究,在此基础上,对补料培养的重要因素如补料种类、补料方式等进行研究。最后,利用高密度培养的重组大肠杆菌作为全细胞催化剂进行丙谷二肽的合成。确定了最佳半合成培养基的组成为:葡萄糖质量浓度为10g/L、混合氮源质量浓度为24g/L、KH2PO4质量浓度为4.62g/L、K2HPO4质量浓度为25.08g/L;确定了溶氧反馈补料的最佳补料控制条件,在30h内,菌体OD620值最高达到了67,是优化前摇瓶培养的14倍。丙谷二肽的质量浓度达到34.56g/L,生产效率约为7g/(L·min)。研究为高效低成本生产丙谷二肽奠定了基础。

关键词：丙谷二肽转酯酶高密度发酵过程控制优化设计

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丙谷二肽的生物合成研究进展

中国食品添加剂 2022年第11期33卷 240-245页

作者：陈祥娥陈关祥王涛济宁医学院生物科学学院日照276826 山东师范大学生命科学学院济南250014

丙谷二肽是一种重要的氨基酸类营养补充剂,具有广泛的药理学活性,在医疗与营养健康方面具有重要的应用价值。本文对丙谷二肽的理化性质、临床应用及生物合成进行了综述,以期对丙谷二肽的生物合成具有较系统的认识。

关键词：丙谷二肽谷氨酰胺 L-氨基酸连接酶 α-氨基酸酯酰基转移酶生物合成

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丙谷二肽对γ射线致小鼠肺组织损伤的防护作用

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郑州大学学报（医学版） 2014年第4期49卷 487-490页

作者：任雪玲汤宁白丽陈斌李莹辉赵玉芬郑州大学药学院郑州450001 郑州大学第一附属医院感染科郑州450052 航天医学基础与应用国家重点实验室北京100094 郑州大学化学与分子工程学院河南省磷化工工程研究中心郑州450052

目的:探讨N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(丙谷二肽)对γ射线致小鼠肺组织损伤的防护作用及可能的作用机制。方法:将27只雄性昆明小鼠随机分为正常对照组、辐射组和丙谷二肽组,每组9只。丙谷二肽组按照1 000 mg/kg的剂量灌胃给药,1次/d,连续... 详细信息

目的:探讨N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(丙谷二肽)对γ射线致小鼠肺组织损伤的防护作用及可能的作用机制。方法:将27只雄性昆明小鼠随机分为正常对照组、辐射组和丙谷二肽组,每组9只。丙谷二肽组按照1 000 mg/kg的剂量灌胃给药,1次/d,连续7 d。然后辐射组、丙谷二肽组均给予4.0 Gy60Coγ射线照射3 d,正常对照组不作处理。照射后测定小鼠肺脏指数、肺组织超氧化物歧化酶(SOD)活性,MTT法测定肺组织细胞增殖率,AnnexinV和PI双染法测定细胞凋亡率,Western blot法检测肺组织Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果:3组小鼠肺脏指数、肺组织SOD活性、细胞凋亡率、肺组织Bcl-2和Bax蛋白表达水平差异均有统计学意义(F=6.352、51.459、462.790、74.434和675.500,P丙谷二肽组肺组织SOD活性显著升高,细胞凋亡率降低(P均丙谷二肽对60Coγ射线辐射损伤小鼠肺组织具有一定的防护作用,这种保护作用可能与调控Bcl-2、Bax表达有关。

关键词：丙谷二肽辐射损伤 Bcl-2 Bax 肺小鼠

基于金属有机沸石咪唑骨架的固定化细胞的制备及其在丙谷二肽制备中的应用

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生物工程学报 2023年第3期39卷 1131-1141页

作者：张营康程婷赵飞扬易炎琴李青清卢振华吴绵斌王涛刘晓环济宁医学院生物科学学院山东日照276800 浙江大学化学工程与生物工程学院浙江杭州310000

来源于鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium siyangensis)中的α-氨基酸酯酰基转移酶(α-amino acid ester acyltransferase, SAET),是目前发现的丙谷二肽催化合成能力最高的酶之一,能够以非保护的L-丙氨酸甲酯盐酸盐、L-谷氨酰胺合成L-丙氨酰... 详细信息

来源于鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium siyangensis)中的α-氨基酸酯酰基转移酶(α-amino acid ester acyltransferase, SAET),是目前发现的丙谷二肽催化合成能力最高的酶之一,能够以非保护的L-丙氨酸甲酯盐酸盐、L-谷氨酰胺合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺[即丙谷二肽(L-alanyl-L-glutamine, Ala-Gln)]。为了解决其在催化过程中的稳定问题,本研究在水相体系中采用“一步法”快速制备固定化细胞(SAET@ZIF-8),在构筑金属有机沸石咪唑骨架结构(ZIF-8)的同时,将表达有SAET的大肠杆菌(Escherichia coli)包裹在其内部空间中。在此基础上,对其结构、催化活性和重复使用性及储存稳定性等催化性能进行探究。结果表明,通过该方法制备的SAET@ZIF-8纳米颗粒与文献报道的ZIF-8材料的形貌基本相同,细胞的引入没有明显改变ZIF-8的形貌。重复使用7次后,SAET@ZIF-8仍能保持67%左右的初始酶活;室温下放置4d时,固定化酶还保留有50%左右的初始酶活,表明SAET@ZIF-8具有较好的重复使用及储存稳定性。将SAET@ZIF-8用于丙谷二肽的催化实验中,当反应30min后丙谷二肽的浓度达到62.83mmol/L(13.65g/L),时空产率达到0.455 g/(L·min),相对于谷氨酰胺的转化率为62.83%。以上结果表明,基于金属有机沸石咪唑骨架的固定化细胞是一种高效制备丙谷二肽的方法策略。

关键词： α-氨基酸酯酰基转移酶金属有机框架沸石咪唑酸酯骨架-8 丙谷二肽固定化

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丙谷二肽合成工艺改进

丙谷二肽合成工艺改进

作者：柯远济南大学

学位级别：硕士

谷氨酰胺是人体内含量丰富的一种肠道必需氨基酸，参与人体代谢，正常状态下体内合成能够满足代谢需要，当创伤、剧烈运动、感染等应急和高分解代谢状态时，L-谷氨酰胺的需要量明显增加，人体合成L-谷氨酰胺的量不足，就需要体外补充谷... 详细信息

谷氨酰胺是人体内含量丰富的一种肠道必需氨基酸，参与人体代谢，正常状态下体内合成能够满足代谢需要，当创伤、剧烈运动、感染等应急和高分解代谢状态时，L-谷氨酰胺的需要量明显增加，人体合成L-谷氨酰胺的量不足，就需要体外补充谷氨酰胺。由于谷氨酰胺化学性质不稳定，水溶性差、能分解出有毒物质等，导致它在肠外营养的使用中受到限制，需要找到合适的替代品。N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽简称丙谷二肽，可在体内分解出谷氨酰胺，满足人体代谢需要，且它的化学性质稳定，水溶性好，无毒，因此丙谷二肽可作为肠外营养剂使用。丙谷二肽在国外应用非常广泛，自从我国引进后，它的市场需求量越来越大，市场前景广阔。现有的丙谷二肽的合成方法有DCC偶联法，有机磷试剂法，NCA法、谷氨酸法等。本论文是关于丙谷二肽的合成工艺的改进，目的是改进由L-乳酸甲酯、二氯亚砜、谷氨酰胺为原料合成丙谷二肽的生产工艺，考察各步反应的影响因素，确定最佳工艺条件，提高丙谷二肽的收率，降低生产成本。经过研究取得的实验成果如下：L-乳酸甲酯与二氯亚砜进行氯代反应，回流温度为70℃，吡啶作催化剂，n(L-乳酸甲酯）：n(二氯亚砜）=1:1.1，几乎定量得到D-2-氯丙酸甲酯粗品;D-2-氯丙酸甲酯水解，pH值为10;两步反应生成D-2-氯丙酸，总收率达到73%，纯度达97.6%。D-2-氯丙酸与二氯亚砜进行氯代反应，回流温度为70℃，DMF作催化剂，n(D-2-氯丙酸）：n(二氯亚砜）=1:1.2，得到产品D-2-氯丙酰氯，收率达到90%，纯度达99%以上。由L-乳酸甲酯合成D-2-氯丙酸总收率达65.7%（文献报道为54%）。D-2-氯丙酰氯与谷氨酰胺进行酰化反应，氢氧化钠作缚酸剂，甲苯/水作两相溶剂，n(L-谷氨酰胺):n(D-2-氯丙酰氯):n(氢氧化钠）=1:1.2:2.4，低温下反应得到产物N-(D-2-氯代丙酰)-L-谷氨酰胺，收率达89%，纯度达96%。N-(D-2-氯代丙酰)-L-谷氨酰胺与28%的氨水进行氨解反应合成丙谷二肽，反应温度为60℃，粗品收率达78%，纯度为97.8%。粗品精制后纯度达99.6%，收率为90%。改进后的丙谷二肽合成路线，反应条件温和，原料价廉易得，成本低，反应过程简单，操作方便，产品收率提高，适合工业化生产。

关键词： L-乳酸甲酯丙谷二肽谷氨酰胺合成肠外营养剂

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丙谷二肽的酶促合成研究

丙谷二肽的酶促合成研究

作者：于清新天津大学

学位级别：硕士

本文以重要的肠外营养用药——丙谷二肽的酶法制备为核心内容,设计完成了包括引入保护基、催化肽键合成、脱保护基三步构成的完整合成工艺路线,并对主要酶促合成工艺条件进行了分析优化;在此基础上,引入CLEA技术,对合成中涉及的两种重... 详细信息

本文以重要的肠外营养用药——丙谷二肽的酶法制备为核心内容,设计完成了包括引入保护基、催化肽键合成、脱保护基三步构成的完整合成工艺路线,并对主要酶促合成工艺条件进行了分析优化;在此基础上,引入CLEA技术,对合成中涉及的两种重要酶制剂——木瓜蛋白酶和青霉素G酰化酶进行新型固定化酶技术开发,优化制备条件,考察催化性质,表征形貌结构;同时,开展CLEA微囊化方法的探索研究,为丙谷二肽的高收率、低成本制备提供有益参考,主要研究结果如下:酶促合成丙谷二肽:以木瓜蛋白酶和青霉素G酰化酶为主要反应用酶,成功制得丙谷二肽;全套反应由引入保护基、木瓜蛋白酶酶促肽键合成和青霉素G酰化酶催化脱保护三步构成,各步反应收率最终为86.41%,30.5%和94.8%,总收率为24.98%。;合成过程中,采用HPLC-MS、核磁等手段对产物进行检测鉴定;同时,开发了以制备色谱为主的目标物分离提纯方法。木瓜蛋白酶催化phac-Ala-Gln的合成:反应由动力学控制,通过优化工艺条件,得出在pH8.8,25℃,助溶剂乙醇添加量为1.5mL,游离酶浓度0.02 g/mL,Gln浓度0.5mol/L,Phac-Ala-OMe浓度0.05mol/L,添加KCl浓度为0.1mol/L,反应160min情况下,合成苯乙酰基保护的丙谷二肽收率最高,可达30.5%;将木瓜蛋白酶CLEA应用于反应,15h时收率为9.32%;针对CLEA技术应用中存在的颗粒较小,不利于工业化应用的问题,提出囊化解决方案,制得6种木瓜蛋白酶CLEA微囊,对结构性质进行表征,其中实心海藻酸钙微囊酶活保留最高,达53.42%。青霉素G酰化酶催化脱保护基生成Ala-Gln:将青霉素G酰化酶游离酶应用于Ala-Gln的合成,反应0.33h,收率达94.8%;制备得到青霉素G酰化酶CLEA,优化条件为:饱和硫酸铵溶液为沉淀剂,与酶液体积比为2.3:1时为最适用量,戊二醛为交联剂,浓度0.35%,交联时间为2h,温度4℃,最终酶活保留可达52.61%;所得CLEA的最适温度与游离酶相比提高了10℃,因此可以在较高温度下应用;最适pH与游离酶相比向碱性偏移了两个单位,适用范围拓宽;热失活研究表明,高温下青霉素G酰化酶CLEA的热稳定性比游离酶明显提高,反应1.0h,收率为95.6%;实验制得两种青霉素G酰化酶CLEA微囊,其中中空微囊酶活保留可达16.84%,机械强度最高可达7.95 N;将青霉素G酰化酶CLEA微囊应用于反应,2.2h时,收率为95.2%。

关键词：丙谷二肽酶促肽合成 CLEA CLEA微囊

响应面法优化重组大肠杆菌全细胞催化合成丙谷二肽

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中国食品添加剂 2021年第9期32卷 58-65页

作者：上官丁从范玉娜郭冯喆李琪杨静文张洪斌胡雪芹合肥工业大学食品与生物工程学院合肥230009

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine,丙谷二肽)是重要的肠外营养补充剂,有着广泛的应用。本文利用表达α-氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠杆菌QC01,进行全细胞催化法合成丙谷二肽。通过最陡爬坡实验筛选出对全细胞催化影响最显著... 详细信息

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine,丙谷二肽)是重要的肠外营养补充剂,有着广泛的应用。本文利用表达α-氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠杆菌QC01,进行全细胞催化法合成丙谷二肽。通过最陡爬坡实验筛选出对全细胞催化影响最显著的三个因素:QC01细胞浓度、底物比例和反应温度,再利用响应面实验,研究了这三个因素的交互作用。最终确定全细胞催化条件为:QC01细胞浓度3g/L、底物丙氨酸甲酯盐酸盐与谷氨酰胺的摩尔比为1∶0.6、反应温度30℃、底物浓度(以丙氨酸甲酯为准)300mmol/L、反应起始pH9.0、反应时间为40min,优化后底物转化率从22.75%提高到73.85%,为全细胞法制备丙谷二肽的工业化生产提供借鉴。

关键词：丙谷二肽全细胞催化响应面催化条件优化

日粮添加谷氨酰胺、苏氨酸、丙谷二肽对断奶仔兔生长性能、器官发育及血清抗氧化指标的影响

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畜牧与兽医 2023年第10期55卷 16-20页

作者：秦枫邵乐李健潘孝青杨杰翟频张霞李晟孙以团江苏省农业科学院畜牧研究所江苏南京210014 农业部种养结合重点实验室江苏南京210014

旨在探讨日粮添加谷氨酰胺、苏氨酸、丙谷二肽对断奶仔兔生长性能、器官发育及血清抗氧化指标的影响。选择健康、体重相近的仔兔60窝,随机分为4组,每组5个重复,每个重复3窝,分别饲喂基础日粮(对照组),基础日粮+0.3%谷氨酰胺+0.3%苏氨酸... 详细信息

旨在探讨日粮添加谷氨酰胺、苏氨酸、丙谷二肽对断奶仔兔生长性能、器官发育及血清抗氧化指标的影响。选择健康、体重相近的仔兔60窝,随机分为4组,每组5个重复,每个重复3窝,分别饲喂基础日粮(对照组),基础日粮+0.3%谷氨酰胺+0.3%苏氨酸(试验I组),基础日粮+0.6%谷氨酰胺+0.3%苏氨酸(试验Ⅱ组),基础日粮+0.06%丙谷二肽+0.3%苏氨酸(试验Ⅲ组)。试验组、对照组分别在28和35日龄时断奶,试验期21 d,记录个体重、死亡率,试验末屠宰采集血样检测抗氧化指标,记录器官重。结果表明:1)各试验组与对照组仔兔个体重无显著差异(P>0.05),试验组死亡率高于对照组。综合分析,试验Ⅱ组生长性能与对照组相近,35和49日龄个体重高于对照组,平均日增重(ADG)与对照组基本一致,仅死亡率高于对照组。2)试验Ⅲ组肝脏重量显著高于试验Ⅱ组(P0.05)。3)各组之间血清常规指标及相关酶活力无显著差异(P>0.05),日粮添加谷氨酰胺、苏氨酸、丙谷二肽后,仔兔28日龄断奶并未影响仔兔机体代谢,更未影响仔兔的健康。4)各组血清抗氧化指标无显著差异(P>0.05),但试验组血清超氧化物歧化酶(SOD)活力均有提高,其中试验Ⅱ、Ⅲ组提高了9.58%、7.62%,丙二醛(MDA)含量分别下降19.3%、16.0%。综上,在本试验条件下,28日龄断奶仔兔饲喂添加谷氨酰胺、苏氨酸或丙谷二肽日粮后的生长性能、器官发育、血清生化指标与对照组35日龄断奶仔兔相互之间无显著差异,3个试验组中,添加0.6%谷氨酰胺和0.3%苏氨酸的试验Ⅱ组比其他2个试验组效果要好,且提高了仔兔的抗氧化能力,促进仔兔机体健康。

关键词：谷氨酰胺苏氨酸丙谷二肽仔兔抗氧化能力

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α-氨基酸酯酰基转移酶工程菌构建、表达及其催化合成丙谷二肽的研究

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α-氨基酸酯酰基转移酶工程菌构建、表达及其催化合成丙谷二肽的...

作者：刘鹏飞合肥工业大学

学位级别：硕士

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine,丙谷二肽)因其具有高热稳定性、高水溶性并且无生理毒性,常被作为L-谷氨酰胺的载体应用于临床。α-氨基酸酯酰基转移酶(α-amino acid ester acyltransferase,AET)能够催化底物L-丙氨酸甲酯... 详细信息

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine,丙谷二肽)因其具有高热稳定性、高水溶性并且无生理毒性,常被作为L-谷氨酰胺的载体应用于临床。α-氨基酸酯酰基转移酶(α-amino acid ester acyltransferase,AET)能够催化底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐、L-谷氨酰胺合成丙谷二肽。本文构建了一株产α-氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠杆菌,并对其发酵条件、酶学性质及催化应用进行了研究。本论文首先将来源于*** ATCC 14234和siyangensis AJ2458的α-氨基酸酯酰基转移酶的编码基因进行密码子优化,然后经全基因合成并将其导入到不同的质粒载体,构建了SAET-QC01、SAET-QC02、EAET-DW01三组重组菌株,其中SAET-QC01的产量显著高于其他菌株,更适合α-氨基酸酯酰基转移酶的表达。其次对SAET-QC01的发酵条件经优化确定为:甘油0.5%、胰蛋白胨0.5%、酵母浸粉1%、无水硫酸镁0.1%、初始pH 6.3,诱导温度为20℃,诱导初始菌浓OD=2.0-2.5,IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导时间12 h,优化后酶活力从221.6 U/mL提升到998.0 U/m L,提高了将近5倍。通过Ni-NTA亲和层析法分离纯化重组蛋白,测定其分子量约为68 k Da。研究该酶的酶学性质发现其最适温度为27℃,最适p H 8.5,在p H 7.0-8.0很稳定,在酸性条件下相对稳定;金属离子及化合物对该酶活力有一定的影响,在一定浓度范围内,低浓度的Co和低浓度的EDTA对酶活有促进作用,高浓度的Fe,Ni,SDS对该酶有明显的抑制作用;并测得该酶的Km和Vmax的值分别为0.30 mol/L和0.02 mol/min·g。再对其催化应用进行了初步的探索,利用重组α-氨基酸酯酰基转移酶制备丙谷二肽,在加酶量为50 U/mmol,底物谷氨酰胺和丙氨酸甲酯盐酸盐的添加比例为0.8,当丙氨酸甲酯盐酸盐的浓度为100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L、500 mmol/L、600 mmol/L,丙谷二肽的产量分别为15.1 g/L,29.2g/L、42.3 g/L、56.2 g/L、69.5 g/L、78.2 g/L,相对于谷氨酰胺的转化率为86.7%,84.0%,81.1%,80.9%,80.0%,75.0%。最后将催化产物进行初步的分离纯化,并对其进行了结构表征,确定了丙谷二肽的结构特点。本论文研究确定α-氨基酸酯酰基转移酶具有良好的酸碱耐受性,催化效率高的优良特性,在工业生产中具有较好的应用潜力。

关键词： α-氨基酸酯酰基转移酶丙谷二肽表达条件酶学性质催化条件