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免疫学杂志 2017年第11期33卷 996-1002页

作者：安志远黄骁舾丁文一首都医科大学附属北京朝阳医院医学研究中心北京100020 中国医学科学院北京协和医院检验科 100730

目的构建鲍曼不动杆菌ATCC19606(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)外膜蛋白A(outer membrane protein A,OmpA)的真核表达载体pEGFP-OmpA,研究OmpA对Hela细胞自噬的影响。方法采用PCR方法扩增鲍曼不动杆菌ATCC19606的OmpA基因,将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1,以构建重组质粒pEGFP-OmpA;用脂质体转染法将其转染Hela细胞;流式细胞术、细胞免疫荧光和Western blot检测OmpA表达水平;激光共聚焦显微镜检测OmpA在Hela细胞中的定位;Western blot及透射电子显微镜检测OmpA对Hela细胞自噬的影响。结果经双酶切及测序鉴定表明pEGFP-OmpA质粒构建成功;OmpA可以大量表达于Hela细胞的细胞质和细胞核中;OmpA可导致Hela细胞中自噬相关蛋白LC3BⅡ、p62和Beclin-1表达升高,而且在Hela细胞中发现自噬小体;OmpA会干扰p62降解,引发不完全自噬。结论本研究成功构建pEGFP-OmpA真核表达载体,它可以在Hela细胞中高效表达,并可导致Hela细胞不完全自噬,这为将来进一步研究鲍曼不动杆菌OmpA引起自噬的机制奠定基础。

关键词：鲍曼不动杆菌外膜蛋白A Hela细胞系不完全自噬

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胞内劳森菌诱导IPEC-J2不完全自噬促进其胞内存活机制

胞内劳森菌诱导IPEC-J2不完全自噬促进其胞内存活机制

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作者：李剑男南京农业大学

学位级别：硕士

猪增生性肠炎(Porcine proliferative enteritis,PPE),是由胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)感染引起的一种肠道传染性疾病,给全世界养猪业带来严重经济损失。PPE可分为急性增生性出血性肠炎(PHE)和慢性猪肠腺瘤样病(PIA),临床... 详细信息

猪增生性肠炎(Porcine proliferative enteritis,PPE),是由胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)感染引起的一种肠道传染性疾病,给全世界养猪业带来严重经济损失。PPE可分为急性增生性出血性肠炎(PHE)和慢性猪肠腺瘤样病(PIA),临床主要表现为生长缓慢、间歇性腹泻、饲料转化率下降和突然死亡,病理上可见回肠壁褶皱增厚,肠道上皮隐窝细胞大量增生。LI是一种严格胞内寄生菌,培养条件苛刻,目前全世界只有少数实验室能够分离培养该菌,导致与其相关的研究报道并不深入。自噬作为一种高度保守的细胞分解代谢途径,在胞内菌感染过程中发挥重要作用,部分胞内菌可以利用自噬帮助其存活和增殖。本研究以实验室分离的LI菌株LJS19051为研究对象,猪小肠上皮细胞IPEC-J2为体外感染模型,探究LI感染是否能够诱导细胞自噬以及自噬对LI胞内存活的影响,研究结果可以为进一步制定PPE的有效防控方案提供理论依据。***19051感染可诱导IPEC-J2不完全自噬并有利于其胞内存活为探究LJS19051感染能否诱导IPEC-J2自噬,首先利用荧光定量PCR和Western Blot实验检测LC3B转录和LC3Ⅱ蛋白水平。结果发现,LJS19051感染IPEC-J2 LC3B转录和LC3Ⅱ蛋白水平均显著升高,在感染120 h时达到高峰。转染重组真核载体p EGFP-C3-LC3B并在LJS19051感染120 h通过共聚焦显微镜观察,发现IPEC-J2质中出现明显的LC3Ⅱ点状聚集。以上结果表明LJS19051感染能诱导IPEC-J2发生自噬。细胞自噬分为完全自噬和不完全自噬,完全自噬可以帮助机体清除胞内病原菌,而部分胞内菌如流产布鲁氏菌、结核分枝杆菌等在感染过程中可以通过阻断自噬体与溶酶体融合形成不完全自噬逃避溶酶体对其杀伤作用甚至促进其增殖。为探究LJS19051感染诱导IPEC-J2自噬的类型,通过自噬LC3双标腺病毒感染实验发现,LJS19051感染120 h IPEC-J2中自噬流被阻断;此外,荧光定量PCR和Western Blot实验结果发现,自噬底物蛋白p62水平升高,且没有随着自噬增强发生降解,而是产生聚积。以上结果说明LJS19051感染诱导IPEC-J2发生不完全自噬。进一步研究自噬对LJS19051胞内存活的影响,LJS19051感染前分别用自噬抑制剂3-MA和自噬激活剂RAPA处理IPECJ2,IFA观察发现,激活自噬后,细胞内LI含量增加,抑制自噬后,细胞内LI含量减少,表明LJS19051感染诱导IPEC-J2发生的不完全自噬有利于其胞内存活。***19051感染通过下调IPEC-J2 Rab7、STX17和Vamp8的表达阻断自噬体与溶酶体融合自噬体识别包裹胞内病原菌后需要与溶酶体融合形成自噬溶酶体,在溶酶体酶作用下才能对其进行杀伤和降解,部分病原菌通过阻断自噬溶酶体形成帮助其实现胞内存活。本研究发现,LJS19051感染可诱导IPEC-J2不完全自噬,但机制尚不明确。为探究LJS19051感染诱导IPEC-J2不完全自噬的机制,利用荧光定量PCR检测LJS19051感染120 h IPEC-J2中自噬体-溶酶体融合关键基因Rab7、STX17和Vamp8的转录水平。结果发现,与自噬激活剂RAPA处理组相比,LJS19051感染120 h细胞中上述三种蛋白转录水平明显降低。为了进一步探究Rab7、STX17和Vamp8对于LI胞内存活的影响,构建重组真核载体p EGFP-C3-Rab7/STX17/Vamp8,共转染IPEC-J2,通过荧光显微镜观察和荧光定量PCR检测结果证明上述三种基因成功在IPEC-J2中过表达。Western Blot实验结果表明,与LJS19051感染组相比,共转染组自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达减少,p62发生降解,说明自噬体与溶酶体发生融合。此外,IFA观察发现,共转染组细胞内LI含量明显减少。以上结果说明LJS19051感染通过抑制IPEC-J2中Rab7、STX17和Vamp8表达阻断自噬体与溶酶体融合,从而有利于其胞内存活。***19051通过抑制AKT/mTOR通路和激活ERK1/2通路诱导细胞不完全自噬并有利于其胞内存活细胞自噬受到AKT/mTOR、ERK1/2、AMPK、JNK等多种信号通路的调控。本研究首先通过Western Blot检测LJS19051感染不同时间点IPEC-J2 AKT/mTOR磷酸化水平,结果发现,与Mock组相比,LJS19051感染24 h AKT磷酸化水平开始被抑制,感染72 h mTOR磷酸化水平开始被抑制,在120 h抑制作用最为明显,同时细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ表

关键词：胞内劳森菌不完全自噬胞内存活信号通路 Hsp60蛋白

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鹦鹉热衣原体CPSIT＿0842诱导巨噬细胞不完全自噬并调控细胞凋亡

鹦鹉热衣原体CPSIT＿0842诱导巨噬细胞不完全自噬并调控细胞凋亡

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作者：黄燕茹南华大学

学位级别：硕士

目的:鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci,Cps)是一类多宿主人畜共患病专性胞内病原体,主要引起鸟类以及包括人类在内的各种哺乳动物致命性呼吸系统疾病。如果没有及时治疗,将会导致潜伏性持续感染。包涵体膜蛋白(Inclusion membrane prot... 详细信息

目的:鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci,Cps)是一类多宿主人畜共患病专性胞内病原体,主要引起鸟类以及包括人类在内的各种哺乳动物致命性呼吸系统疾病。如果没有及时治疗,将会导致潜伏性持续感染。包涵体膜蛋白(Inclusion membrane protein,Inc)是位于宿主与病原体界面的重要毒力蛋白,在维持包涵体内稳态和避免宿主细胞免疫杀伤中发挥重要作用。然而,Inc在Cps发病机制中的作用仍然知之甚少。本研究以THP-1分化的巨噬细胞为研究对象,初步探究了Cps包涵体膜蛋白CPSIT＿0842对巨噬细胞自噬和凋亡的影响,为进一步阐明Cps的发病机制和持续性感染提供实验依据。方法:(1)将表达载体p ET28a/CPSIT＿0842质粒转化至感受态大肠杆菌中,成功诱导表达出与预测分子量35 KDa相近的可溶性重组蛋白CPSIT＿0842。使用浓度为100μg/m L的PMA处理THP-1细胞36 h分化为贴壁样巨噬细胞后,不同浓度的CPSIT＿0842在不同时间段刺激巨噬细胞,实时荧光定量PCR从转录水平检测自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达,Western blot从翻译表达水平检测自噬相关蛋白LC3A/B和Beclin-1的表达;透射电镜观察细胞内自噬小体及自噬溶酶体的形成;免疫荧光观察细胞内源性自噬小体的数量,探究CPSIT＿0842是否能诱导巨噬细胞自噬。(2)不同浓度的CPSIT＿0842在不同时间段刺激巨噬细胞后,通过实时定量PCR和Western blot检测自噬泛素化蛋白聚集物受体P62的转录与表达;分别使用自噬早期抑制剂3-MA,自噬晚期抑制剂Baf A1和自噬促进剂Rap预处理巨噬细胞后,使用最适浓度的CPSIT＿0842作用细胞24 h,Western blot检测LC3A/B和P62的表达,同时免疫荧光检测内源性LC3荧光斑点的形成,探究CPSIT＿0842诱导巨噬细胞自噬的自噬流是否通畅。(3)最适浓度的CPSIT＿0842刺激m Cherry-GFP-LC3腺病毒转染的巨噬细胞,通过荧光显微镜观察细胞内自噬小体与自噬溶酶体的数量;Western blot检测溶酶体相关膜蛋白LAMP1的表达,探究CPSIT＿0842是否阻断自噬体与溶酶体的融合。(4)Western blot检测最适浓度CPSIT＿0842处理巨噬细胞不同时间段ERK、p38和JNK的磷酸化水平;Erk1/2抑制剂PD98059和CPSIT＿0842共处理巨噬细胞,Western blot检测ERK和m TOR的磷酸化水平,自噬相关蛋白LC3A/B和Beclin-1的表达,探究CPSIT＿0842诱导巨噬细胞自噬的分子通路。(5)流式细胞术检测不同浓度CPSIT＿0842作用下巨噬细胞的凋亡率;Western blot检测其促凋亡蛋白蛋白Bax、cleaved-caspase 3和caspase 3,抑凋亡蛋白BCL-2的表达,探究CPSIT＿0842能否促进细胞凋亡。(6)在3-MA,Baf A1,Rap,PD98059预处理巨噬细胞后,选取最适浓度的CPSIT＿0842作用细胞,流式细胞术检测其凋亡率,探究CPSIT＿0842对巨噬细胞自噬和凋亡的影响及其之间的联系。结果:(1)使用不同浓度的CPSIT＿0842刺激THP-1分化的巨噬细胞后,自噬相关蛋白LC3A/B、Beclin-1和P62在转录水平上均被上调;同时,Western blot结果表明CPSIT＿0842上调了LC3A/B和Beclin-1的表达。CPSIT＿0842处理后的细胞在荧光显微镜下,出现较对照组更多的LC3自噬荧光斑点。透射电镜图像显示,与对照组相比,CPSIT＿0842处理组中出现较多的自噬小体与自噬溶酶体。以上结果表明鹦鹉热衣原体包涵体膜蛋白CPSIT＿0842能诱导巨噬细胞自噬的起始。(2)不同浓度的CPSIT＿0842刺激THP-1分化的巨噬细胞后,Western blot结果表明p62表达增加;在研究的工作浓度和时间范围内,浓度为10μg/m L的CPSIT＿0842作用24 h效果较为明显。同时,CPSIT＿0842增加了Baf A1和Rap作用组自噬相关蛋白LC3A/B和P62的表达;而3-MA显著抑制了CPSIT＿0842引起的LC3A/B和P62表达的增加。间接免疫荧光与Western blot结果一致,CPSIT＿0842增加了Baf A1和Rap预处理细胞中荧光自噬小体的聚集;而3-MA显著抑制了CPSIT＿0842引起的自噬体增加。以上结果表明鹦鹉热衣原体包涵体膜蛋白CPSIT＿0842能促进巨噬细胞不完全自噬。(3)免疫荧光结果表明,在CPSIT＿0842刺激m Cherry-GFP-LC3腺病毒成

关键词：鹦鹉热衣原体 CPSIT_0842 不完全自噬细胞凋亡 MAPK/ERK

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MERS冠状病毒3C样蛋白酶是一种新的细胞自噬诱导蛋白

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中国生物化学与分子生物学报 2016年第10期32卷 1132-1140页

作者：解晴陈晓娟邢雅玲陈晓玲陈忠斌安徽医科大学合肥230032 军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京100850

冠状病毒(Coronavirus,Co V)3C样蛋白酶(3CLpro)在冠状病毒复制过程中起重要作用,是一种重要的潜在抗病毒药物候选靶标。细胞自噬是宿主重要抗病毒防御机制之一,但目前冠状病毒诱导细胞自噬及其机制还不很清楚。本研究以人类新发高致病... 详细信息

冠状病毒(Coronavirus,Co V)3C样蛋白酶(3CLpro)在冠状病毒复制过程中起重要作用,是一种重要的潜在抗病毒药物候选靶标。细胞自噬是宿主重要抗病毒防御机制之一,但目前冠状病毒诱导细胞自噬及其机制还不很清楚。本研究以人类新发高致病性冠状病毒——中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V)为研究对象,探讨人类冠状病毒感染与细胞自噬的关系。通过免疫荧光法检测发现,MERS 3CLpro引起细胞内e GFP-LC3B绿色荧光点状聚集,同时MERS 3CLpro诱导自噬标志蛋白微管相关蛋白1-轻链3基(LC3-II)表达增多,表明MERS 3CLpro可激活细胞自噬。进一步研究发现,MERS 3CLpro诱导细胞自噬体形成而阻断或抑制自噬溶酶体形成,即MERS 3CLpro诱导不完全细胞自噬效应,而且MERS 3CLpro诱导细胞自噬具有时间依赖性且不依赖于其蛋白酶催化活性。此外发现SARS-Co V和NL63-Co V等其它人类冠状病毒3CLpro也具有诱导细胞自噬效应,表明3CLpro诱导细胞自噬可能是人类冠状病毒所具有的一种普遍生物学特性。本研究首次发现冠状病毒蛋白酶3CLpro能诱导宿主细胞自噬,是一种新型冠状病毒来源的宿主细胞自噬诱导蛋白,这一发现拓展了对人类冠状病毒蛋白酶功能的新认识,为研究冠状病毒与宿主抗病毒天然免疫以及以病毒蛋白酶为靶标的抗病毒药物研究提供了理论基础。

关键词：中东呼吸综合征冠状病毒 3C样蛋白酶细胞自噬 LC3-II 不完全自噬

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禽致病性大肠杆菌外膜蛋白OmpA对DF-1细胞自噬的影响

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中国畜牧兽医 2023年第5期50卷 1971-1980页

作者：程前高清清王雨禾郇长超高崧扬州大学兽医学院扬州225009 江苏省动物重要疫病与人畜共患病防控协同创新中心扬州225009

【目的】探讨禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)外膜蛋白OmpA对DF-1细胞自噬的影响,为研究OmpA是否协助APEC逃逸宿主细胞自噬介导的清除作用提供依据。【方法】以APEC E058株基因组DNA为模版,通过PCR扩增回收o... 详细信息

【目的】探讨禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)外膜蛋白OmpA对DF-1细胞自噬的影响,为研究OmpA是否协助APEC逃逸宿主细胞自噬介导的清除作用提供依据。【方法】以APEC E058株基因组DNA为模版,通过PCR扩增回收ompA基因片段,经Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆至真核表达载体pEGFP-N1,通过酶切及测序鉴定筛选阳性的重组表达质粒pEGFP-N1-ompA;随后将质粒转染至鸡胚成纤维细胞DF-1并通过Western blotting和免疫荧光试验检测OmpA蛋白的表达情况;通过透射电子显微镜、免疫荧光试验及Western blotting方法检测OmpA对DF-1细胞自噬的影响。【结果】测序鉴定正确的重组质粒pEGFP-N1-ompA经Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切,获得大小分别为1038和4700 bp的条带,大小与载体和目的片段相符,表明真核表达质粒pEGFP-N1-ompA构建成功。将重组质粒经脂质体转染DF-1细胞后,通过免疫荧光试验可观察到大量绿色荧光,Western blotting检测到大小为65 ku的蛋白条带,表明成功转染pEGFP-N1-ompA至DF-1细胞中并大量表达ompA-EGFP融合蛋白。同时Western blotting结果显示,过表达OmpA可引起自噬标志性蛋白LC3Ⅱ的表达量增加;通过透射电子显微镜可观察到DF-1细胞中的自噬小体。将单荧光GFP-LC3质粒转染DF-1细胞,OmpA蛋白处理组呈现绿色荧光点的聚集,说明OmpA引发DF-1细胞自噬。进一步研究发现,OmpA影响自噬标志蛋白p62降解,转染双荧光mRFP-GFP-LC3质粒检测显示OmpA可阻断自噬流的发生。【结论】APEC外膜蛋白OmpA可引起DF-1细胞发生自噬,但其抑制自噬流的发生,引发DF-1细胞的不完全自噬,这将为进一步探讨APEC逃逸宿主细胞的清除作用提供参考。

关键词：禽致病性大肠杆菌 OmpA DF-1细胞系不完全自噬

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一种新的细胞自噬诱导蛋白MERS冠状病毒3C样蛋白酶

一种新的细胞自噬诱导蛋白MERS冠状病毒3C样蛋白酶

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第十一届全国免疫学学术大会

作者：解晴陈晓娟邢雅玲陈晓玲陈忠斌安徽医科大学军事医学科学院放射与辐射医学研究所

目的:冠状病毒3C样蛋白酶(3CLpro)在冠状病毒复制过程中起重要作用,是一种重要的潜在抗病毒药物候选靶标。细胞自噬是宿主重要抗病毒防御机制之一,但目前冠状病毒诱导细胞自噬及其机制还不很清楚。本研究以人类新发高致病性冠状病毒---... 详细信息

目的:冠状病毒3C样蛋白酶(3CLpro)在冠状病毒复制过程中起重要作用,是一种重要的潜在抗病毒药物候选靶标。细胞自噬是宿主重要抗病毒防御机制之一,但目前冠状病毒诱导细胞自噬及其机制还不很清楚。本研究以人类新发高致病性冠状病毒---中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V)为研究对象,探讨人类冠状病毒感染与细胞自噬的关系。方法:通过免疫荧光法检测发现MERS 3CLpro引起细胞内e GFP-LC3B绿色荧光点状聚集,同时MERS3CLpro诱导自噬标志蛋白微管相关蛋白1-轻链3基(LC3-II)表达增多,表明MERS 3CLpro可激活细胞自噬。结果:进一步研究发现MERS 3CLpro诱导细胞自噬体形成而阻断或抑制自噬溶酶体形成,即MERS 3CLpro诱导不完全细胞自噬效应,而且MERS 3CLpro诱导细胞自噬具有时间依赖性且不依赖于其蛋白酶催化活性。此外发现SARS-Co V和NL63-Co V等其它人类冠状病毒3CLpro也具有诱导细胞自噬效应,表明3CLpro诱导细胞自噬可能是人类冠状病毒所具有的一种普遍生物学特性。结论:本研究首次发现冠状病毒蛋白酶3CLpro能诱导宿主细胞自噬,是一种新型冠状病毒来源的宿主细胞自噬诱导蛋白,这一发现拓展了对人类冠状病毒蛋白酶功能的新认识,为研究冠状病毒与宿主抗病毒天然免疫以及以病毒蛋白酶为靶标的抗病毒药物研究提供了理论基础。

关键词： MERS冠状病毒 3C样蛋白酶细胞自噬 LC3-II 不完全自噬

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