胞内劳森菌诱导IPEC-J2不完全自噬促进其胞内存活机制

作     者：李剑男 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：范红结

授予年度：2022年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：胞内劳森菌 不完全自噬 胞内存活 信号通路 Hsp60蛋白 

摘      要：猪增生性肠炎(Porcine proliferative enteritis,PPE),是由胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)感染引起的一种肠道传染性疾病,给全世界养猪业带来严重经济损失。PPE可分为急性增生性出血性肠炎(PHE)和慢性猪肠腺瘤样病(PIA),临床主要表现为生长缓慢、间歇性腹泻、饲料转化率下降和突然死亡,病理上可见回肠壁褶皱增厚,肠道上皮隐窝细胞大量增生。LI是一种严格胞内寄生菌,培养条件苛刻,目前全世界只有少数实验室能够分离培养该菌,导致与其相关的研究报道并不深入。自噬作为一种高度保守的细胞分解代谢途径,在胞内菌感染过程中发挥重要作用,部分胞内菌可以利用自噬帮助其存活和增殖。本研究以实验室分离的LI菌株LJS19051为研究对象,猪小肠上皮细胞IPEC-J2为体外感染模型,探究LI感染是否能够诱导细胞自噬以及自噬对LI胞内存活的影响,研究结果可以为进一步制定PPE的有效防控方案提供理论依据。 ***19051感染可诱导IPEC-J2不完全自噬并有利于其胞内存活 为探究LJS19051感染能否诱导IPEC-J2自噬,首先利用荧光定量PCR和Western Blot实验检测LC3B转录和LC3Ⅱ蛋白水平。结果发现,LJS19051感染IPEC-J2 LC3B转录和LC3Ⅱ蛋白水平均显著升高,在感染120 h时达到高峰。转染重组真核载体p EGFP-C3-LC3B并在LJS19051感染120 h通过共聚焦显微镜观察,发现IPEC-J2质中出现明显的LC3Ⅱ点状聚集。以上结果表明LJS19051感染能诱导IPEC-J2发生自噬。细胞自噬分为完全自噬和不完全自噬,完全自噬可以帮助机体清除胞内病原菌,而部分胞内菌如流产布鲁氏菌、结核分枝杆菌等在感染过程中可以通过阻断自噬体与溶酶体融合形成不完全自噬逃避溶酶体对其杀伤作用甚至促进其增殖。为探究LJS19051感染诱导IPEC-J2自噬的类型,通过自噬LC3双标腺病毒感染实验发现,LJS19051感染120 h IPEC-J2中自噬流被阻断;此外,荧光定量PCR和Western Blot实验结果发现,自噬底物蛋白p62水平升高,且没有随着自噬增强发生降解,而是产生聚积。以上结果说明LJS19051感染诱导IPEC-J2发生不完全自噬。进一步研究自噬对LJS19051胞内存活的影响,LJS19051感染前分别用自噬抑制剂3-MA和自噬激活剂RAPA处理IPECJ2,IFA观察发现,激活自噬后,细胞内LI含量增加,抑制自噬后,细胞内LI含量减少,表明LJS19051感染诱导IPEC-J2发生的不完全自噬有利于其胞内存活。 ***19051感染通过下调IPEC-J2 Rab7、STX17和Vamp8的表达阻断自噬体与溶酶体融合 自噬体识别包裹胞内病原菌后需要与溶酶体融合形成自噬溶酶体,在溶酶体酶作用下才能对其进行杀伤和降解,部分病原菌通过阻断自噬溶酶体形成帮助其实现胞内存活。本研究发现,LJS19051感染可诱导IPEC-J2不完全自噬,但机制尚不明确。为探究LJS19051感染诱导IPEC-J2不完全自噬的机制,利用荧光定量PCR检测LJS19051感染120 h IPEC-J2中自噬体-溶酶体融合关键基因Rab7、STX17和Vamp8的转录水平。结果发现,与自噬激活剂RAPA处理组相比,LJS19051感染120 h细胞中上述三种蛋白转录水平明显降低。为了进一步探究Rab7、STX17和Vamp8对于LI胞内存活的影响,构建重组真核载体p EGFP-C3-Rab7/STX17/Vamp8,共转染IPEC-J2,通过荧光显微镜观察和荧光定量PCR检测结果证明上述三种基因成功在IPEC-J2中过表达。Western Blot实验结果表明,与LJS19051感染组相比,共转染组自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达减少,p62发生降解,说明自噬体与溶酶体发生融合。此外,IFA观察发现,共转染组细胞内LI含量明显减少。以上结果说明LJS19051感染通过抑制IPEC-J2中Rab7、STX17和Vamp8表达阻断自噬体与溶酶体融合,从而有利于其胞内存活。 ***19051通过抑制AKT/mTOR通路和激活ERK1/2通路诱导细胞不完全自噬并有利于其胞内存活 细胞自噬受到AKT/mTOR、ERK1/2、AMPK、JNK等多种信号通路的调控。本研究首先通过Western Blot检测LJS19051感染不同时间点IPEC-J2 AKT/mTOR磷酸化水平,结果发现,与Mock组相比,LJS19051感染24 h AKT磷酸化水平开始被抑制,感染72 h mTOR磷酸化水平开始被抑制,在120 h抑制作用最为明显,同时细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ表