检索结果-南通市图书馆

Twist2诱导上皮细胞间质转分化对结肠癌的增殖和迁移的影响

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

世界华人消化杂志 2014年第36期22卷 5665-5670页

作者：李义贵航贵阳医院普外科贵州省贵阳市550009

目的:探讨Twist2在膀胱癌形成中的机制,希望为解决临床实际问题提供了理论依据,具有重要的理论价值意义.方法:实时定量PCR和Western blot检测在肿瘤上皮-间充质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程中基因m RNA表达... 详细信息

目的:探讨Twist2在膀胱癌形成中的机制,希望为解决临床实际问题提供了理论依据,具有重要的理论价值意义.方法:实时定量PCR和Western blot检测在肿瘤上皮-间充质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程中基因m RNA表达水平的变化,流式细胞标技术检测对照组和实验组中与肿瘤干细胞亚群的表达变化.细胞迁移实验结果(刮痕实验)和细胞侵袭实验检测结肠癌细胞株的迁移和侵袭的变化.结果:实时定量PCR和Western blot检测结果表明,实验组EMT相关标志物E-cadherin和N-cadherin在m RNA水平的表达分别上调和下调(P细胞标技术检测对照组和实验组中与肿瘤干细胞亚群的表达变化.其中实验组肿瘤干细胞CD44+/C D24-的亚群相比于对照组有明显的上调,具有统计学意义(P细胞发生EMT来提高肿瘤干细胞的比例.细胞迁移实验结果(刮痕实验)和细胞侵袭实验,显示Twist过表达细胞与SW480空载细胞相比,出现了明显的迁移和侵袭运动,说明Twist可以促进结肠癌细胞株的迁移和侵袭.结论:Twist2蛋白可能通过抑制E-cadherin基因转录活性,诱发结肠癌细胞发生EMT来提高肿瘤干细胞的比例和自我更新的能力来促进结肠癌的发生和发展.

关键词： Twist2 上皮-间充质细胞转分化肿瘤干细胞结肠癌

活性维生素D3对阿霉素诱导的足细胞转分化的干预作用

维普期刊数据库评论

在线全文

维普期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

活性维生素D3对阿霉素诱导的足细胞转分化的干预作用

作者：谢瑛玲福建医科大学

学位级别：硕士

目的：探讨活性维生素D3对阿霉素诱导的足细胞上皮-间充质细胞转分化的干预作用方法：以体外培养的小鼠足细胞系为研究对象，分六组进行实验：正常组（C组）、阿霉素组（即模型组，ADR组，0.5μg/ml）、低剂量活性维生素D3组（LVD组... 详细信息

目的：探讨活性维生素D3对阿霉素诱导的足细胞上皮-间充质细胞转分化的干预作用方法：以体外培养的小鼠足细胞系为研究对象，分六组进行实验：正常组（C组）、阿霉素组（即模型组，ADR组，0.5μg/ml）、低剂量活性维生素D3组（LVD组，1nmol/L）、高剂量活性维生素D3组（HVD组，10nmol/L）、缬沙坦组（ARB组，10μmol/L）、缬沙坦＋高剂量活性维生素D3组（AHVD组）。各实验组干预24h、48h后通过MTT法检测各组足细胞的增殖;通过流式细胞术检测各组足细胞的凋亡率，同时24h、48h后通过RT-PCR测synaptopodin、P-cadherin、desmin、FSP-1、TGF-β、β-catenin mRNA的表达。Western Bolt检测各组干预24h、48h后synaptopodin、P-cadherin、desmin、β-catenin蛋白的表达。结果： 1、MTT结果显示：24h及48hADR组足细胞增殖能力明显下降﹙P＜0.01﹚;与ADR组相比，24h及48h LVD组、HVD组、ARB组、AHVD组细胞增殖能力增加﹙P＜0.01﹚。 2、24h及48h后，ADR组synaptopodin mRNA及蛋白表达均下降﹙P＜0.01﹚。24h时与ADR组相比，ARB组、LVD组、HVD组、AHVD组synaptopodin mRNA表达均升高（P＜0.01），四个药物干预组之间无显著差异。48h时与ADR组相比，LVD组及HVD组synaptopodin mRNA及蛋白表达均升高（P＜0.05）。然而与ADR组相比，24h及48hARB组synaptopodin蛋白表达均下降（P＜0.01）。24h及48h后，ADR组P-cadherin mRNA及蛋白表达均下降﹙P＜0.01﹚;与ADR组相比，ARB组、LVD组、HVD组P-cadherin mRNA及蛋白表达均升高（P＜0.05），但是未上调至正常水平。AHVD组在24h蛋白水平上未达显著差异（P＞0.05）。 3、24h及48h后，ADR组desmin mRNA及蛋白表达上调（P＜0.01）。与ADR组相比，24h及48hLVD组、HVD组、ARB组、AHVD组desmin mRNA及蛋白表达均下调﹙P＜0.01﹚。24h时与正常对照组相比，ADR组FSP-1mRNA表达上调﹙P＜0.01﹚;与ADR组相比，LVD组、HVD组、ARB组、AHVD组FSP-1mRNA表达均下调﹙P＜0.01﹚。48h时与正常对照组相比，ADR组FSP-1mRNA表达略有上调，但未达统计学意义;与ADR组相比，LVD组、HVD组、AHVD组FSP-1mRNA表达均有所下调﹙P＜0.05﹚。 4、24h及48h后，ADR组足细胞β-catenin mRNA及蛋白表达均上调﹙P＜0.01﹚。与ADR组相比，LVD组、HVD组、ARB组、AHVD组β-catenin mRNA及蛋白表达均下调﹙P＜0.05﹚。24h时与正常对照组相比，ADR组TGF-βmRNA表达上调﹙P＜0.01﹚;与ADR组相比，ARB组、LVD组、HVD组、AHVD组TGF-βmRNA表达明显下调﹙P＜0.01﹚。48h时与正常对照组相比，ADR组TGF-βmRNA表达上调﹙P＜0.01﹚;与ADR组相比，HVD组与AHVD组TGF-βmRNA表达明显下调﹙P＜0.01)，其他两组无显著差异。结论： 1、阿霉素可诱导足细胞发生EMT，建立体外小鼠足细胞EMT模型。 2、活性维生素D3可通过修复足细胞synaptopodin、P-cadherin及抑制足细胞desmin、FSP-1的表达来拮抗足细胞的损伤，说明活性维生素D3可通过抑制足细胞发生EMT而起到保护足细胞的作用，且无剂量及时间依赖性。 3、目前实验剂量的缬沙坦与高剂量活性维生素D3对足细胞EMT的抑制作用无协同作用。 4、我们的实验证实：活性维生素D3通过抑制信号转导通路中β-catenin、TGF-β的表达而抑制足细胞发生EMT。

关键词：活性维生素D3 足细胞上皮-间充质细胞转分化

维生素D受体在高糖导致的小鼠足细胞转分化中的作用

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

维生素D受体在高糖导致的小鼠足细胞转分化中的作用

作者：张方兴郑州大学

学位级别：硕士

背景及目的糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病患者最常见的慢性并发症和微血管病变之一,发病率在逐年攀升,其也已经为终末期肾脏病（end-stage renal disease,ERSD）的主要病因。足细胞为肾小球的脏层上皮细胞,被覆于肾小... 详细信息

背景及目的糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病患者最常见的慢性并发症和微血管病变之一,发病率在逐年攀升,其也已经为终末期肾脏病（end-stage renal disease,ERSD）的主要病因。足细胞为肾小球的脏层上皮细胞,被覆于肾小球的基底膜（glomerular basement membrane,GBM）之上,是肾小球滤过屏障的其中的主要构成之一。糖尿病肾病中肾小球病理生理方面的改变除了基底膜增厚和系膜基质的增生外,足细胞的数量和相关功能的改变在糖尿病肾病的发生发展的过程中也起到了相当重要的作用。因此DN蛋白尿的发生、发展与足细胞的转分化（EMT）及屏障功能损伤密不可分。维生素D受体（VDR）是核受体超家族的一员,广泛分布于多种组织、细胞,如肝细胞、胰岛细胞、肾小管上皮细胞及肾小球足细胞等。维生素D（VD）-VDR信号系统具有调控基因表达、钙磷代谢、细胞迁移和分化、免疫反应等多种作用,并且这些调控作用依赖于VDR的表达水平及活性。有研究表明,VDR在长期慢性肾脏病、终末期肾脏病及长期糖尿病导致的微炎症状态的患者体内有表达量减少的趋势,但关于VDR与糖尿病肾病足细胞转分化之间的关系的研究甚少。Wnt信号通路是介导足细胞发生EMT的重要通路之一。我们前期的实验结果也已证实,Wnt信号通路关键分子—糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）和β-catenin在高糖刺激下的足细胞中表达增加,导致间充质细胞标记蛋白表达增多,促进足细胞的EMT过程,使屏障功能受损。但在高糖环境中三者如何相互影响,机制不清。帕立骨化醇（Paricalcitol）是一种VDR激动剂,对肾脏有多个方面的保护作用。本实验利用VDR激动剂—帕立骨化醇在细胞水平研究VDR对Wnt信号通路关键分子的表达调控作用以及VDR对高糖造成的足细胞表型及功能损害的保护作用。方法以条件永生化小鼠足细胞（MPC-5）为研究对象。1.利用正常糖浓度条件下培养的足细胞检测维生素D受体的表达水平与足细胞表型的关系:将正常糖浓度培养条件下的足细胞分为以下三组:（1）正常糖浓度组:含5.6mmol/L葡萄糖;（2）scramble siRNA组:含5.6mmol/L葡萄糖+100pmol/LscramblesiRNA;（3）VDRsiRNA组:5.6mmol/L葡萄糖+100pmol/L VDRsiRNA。利用western blot和q RT-PCR技术在蛋白及基因水平上检测VDR、GSK-3β、β-catenin、足细胞标记蛋白podocin、nephrin以及间充质细胞标记蛋白α-SMA、MMP9的表达水平。2.VDR激动剂-帕立骨化醇对高糖导致的足细胞EMT及屏障功能损伤的缓解作用:1)帕立骨化醇对高糖造成的足细胞EMT的作用:将培养的足细胞分为正常糖浓度组、正常糖浓度加入DMSO组、正常糖浓度加入帕立骨化醇（0.1μM）组、高糖培养组、高糖浓度加入DMSO组、高糖培养加入帕立骨化醇（0.1μM）组,分别检测细胞中VDR的表达水平、足细胞标记蛋白podocin、nephrin的表达水平,以及间充质细胞标记蛋白α-SMA、MMP9的表达水平。2)帕立骨化醇对高糖造成的足细胞屏障功能损伤的作用:利用白蛋白流量检测上述各处理组的单层脏层上皮细胞的屏障功能。根据一定密度（5×103）,把已经分化成熟的足细胞消化并接种于Transwell小室上层的纤维膜上,等到足细胞相互融合后,更替无血清的1640培养基使足细胞饥饿6-8小时达到同步化,然后再按照上述实验条件依次处理足细胞36小时,而后用已经灭菌的PBS液洗涤细胞两到三次,然后给Transwell小室的下部更替为1ml1640培养基,上部更替为0.3ml含有40mg/ml胎牛血清白蛋白的1640培养基,置于37度中1小时后,取下层培养液,用BCA蛋白浓度检测试剂盒来确定小室下部培养基的蛋白浓度,即白蛋白流量。3.VDR对Wnt信号通路关键分子的表达调控:（1）将培养的足细胞分为正常糖浓度组、正常糖浓度加入DMSO组、正常糖浓度加入帕立骨化醇（0.1μM）组、高糖培养组、高糖浓度加入DMSO组、高糖培养加入帕立骨化醇（0.1μM）组,分别检测细胞中GSK-3β、β-catenin的蛋白表达水平及活性。（2）验证VDR是否通过GSK-3β参与足细胞转分化:正常（5.6m M）培养条件下的足细胞:1)正常对照组:培养基含5.6m M的葡萄糖;2)GSK-3βsiRNA转染组;3)scramble siRNA转染组;4)帕立骨化醇组;5)帕立骨化醇+GSK-3βsiRNA转染组;6)帕立骨化醇+scramble siRNA转染组,36小时后利用western blot和q RT-PCR技术在蛋白及基因水平上检测VDR、β-catenin、足细胞标记蛋白podocin、nephrin以及间充质细胞标记蛋白α-S

关键词：足细胞糖原合成酶激酶3β 上皮-间充质细胞转分化 β-catenin 帕立骨化醇

GSK-3β在高糖环境下足细胞转分化效应中的作用

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

GSK-3β在高糖环境下足细胞转分化效应中的作用

作者：杨莉莉郑州大学

学位级别：硕士

背景糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最常见的微血管并发症之一,也是导致终末期肾脏病(end-stage renal disease, ESRD)的重要原因。蛋白尿是DN最常见的临床表现,也是糖尿病肾病进展的独立危险因素,因此减少蛋白尿是... 详细信息

背景糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最常见的微血管并发症之一,也是导致终末期肾脏病(end-stage renal disease, ESRD)的重要原因。蛋白尿是DN最常见的临床表现,也是糖尿病肾病进展的独立危险因素,因此减少蛋白尿是糖尿病肾病治疗的重要举措。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分,其结构和功能的改变在DN蛋白尿的发生、发展过程中起到了关键的作用。足细胞参与蛋白尿形成的原因很多,机制复杂。作为一种终末分化的脏层上皮细胞,足细胞在某些刺激物的作用下可通过特定程序向间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT),但足细胞在高糖环境下是否发生上皮-间充质转分化以及足细胞的间充质转分化是否参与蛋白尿的形成尚不清楚。目前研究认为,有三条信号通路介导了足细胞的转分化过程,即TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-catenin,而广泛存在于真核生物体内的糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase3β, GSK-3β)是以上三条通路的参与者,但其是否参与高糖环境下足细胞的转分化目前尚不明确。无机离子锂(本课题使用氯化锂)是一种治疗狂躁和抑郁症的药物,是GSK-3β的选择性活性抑制剂,通过锂的作用,抑制高糖环境下GSK-3β的活性,并观察足细胞表型和功能的变化,或许能为糖尿病肾病蛋白尿寻找新的治疗靶点。目的本实验通过观察高糖环境下小鼠足细胞表型和功能的改变、GSK-3β表达量和活性的改变、以及抑制GSK-3β活性和表达量后足细胞表型和功能的变化,来研究GSK-3β在高糖环境下足细胞转分化效应中的作用,并为糖尿病肾病蛋白尿的治疗寻找新的靶点。方法以条件永生化小鼠足细胞为研究对象。 1.高糖环境下检测足细胞表型和功能： (1)不同浓度葡萄糖对足细胞表型的影响：用含不同浓度葡萄糖(12.5、25、50mmol/L)的1640培养基处理足细胞36h,并设正常对照组(5.6mmol/L葡萄糖)和高渗对照组(5.6mmol/L葡萄糖+44.4mmol/L甘露醇),采用Western-blot与间接免疫荧光的方法检测足细胞表面标记蛋白nephrin,podocin和间充质细胞表型标志物α-SMA,Fibronectin的表达;(2)不同浓度葡萄糖刺激足细胞36h后白蛋白流入量的变化：将分化成熟的足细胞以一定密度(5×10)接种于transwell小室上层的聚酯纤维膜上,待细胞融合后,换无血清培养基饥饿8小时,然后使用含不同浓度葡萄糖(5.6、12.5、25、50mmol/L)的1640培养基处理足细胞36小时,36h后使用灭菌PBS洗涤细胞两次,然后给Transwell滤过膜的上部换上0.3ml的RPMI1640培养基,下部充满1ml含40mg/ml胎牛血清白蛋白的RPMI1640培养基,于37℃孵育1小时后,取上层培养液,用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定滤过膜上部培养基的白蛋白浓度,即白蛋白流入量。 2.高糖环境下足细胞GSK-30表达量及活性的变化： (1)不同浓度葡萄糖(5.6、12.5、25、50mmol/L Glu)处理足细胞36h后,用Western-blot检测GSK-3β及其9位丝氨酸位点pSer9GSK-3β(抑制位点)的表达量以及216位酪氨酸位点pTyr216GSK-3β(活化位点)的表达量;(2)不同糖浓度处理的足细胞GSK-3β活性的变化：足细胞按上述浓度分组培养36h后,按照GSK-3β活性检测试剂盒(Genmed Scientific,美国)说明书处理足细胞,依次加入各种试剂,于分光光度计上检测各组样品的OD值,按试剂盒说明书给出的公式计算GSK-3β的活性。 3.应用siRNA干扰GSK-3p后检测足细胞表型及功能：根据Gene Bank数据库提供的小鼠的GSK-3β全长基因(Gene Bank NO.NM-019827.6)由上海吉凯基因化学技术有限公司设计的靶序列mRNA(5’-3’)为：CCACTCAAGAACTGTCAAGTA.,阴性对照的siRNA正义链(5’-3’)序列为：UUCUCCGAACGUGUCACGUtt。应用转染试剂LipofectamineTM2000(invitrogen,美国)将GSK-3βsiRNA以30nmol的浓度转染足细胞36小时后检测各组足细胞nephrin,podocin,a-SMA表达量的变化;同时应用Transwell检测各组的白蛋白流入量以评估足细胞的单层屏障功能。 4.应用GSK-30活性抑制剂后足细胞表型及功能的变化应用LiCl,一种经典的GSK-3β活性抑制剂,观察抑制GSK-3p活性后足细胞表型及功能的变化,或许能为糖尿病肾病蛋白尿的临床治疗提供借鉴。将实验分为正常糖对照组(5.6mmol/L Gl

关键词：足细胞糖原合成酶激酶3β 上皮-间充质细胞转分化转染

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

补体片段C3a在足细胞表型转化中的作用

补体片段C3a在足细胞表型转化中的作用

作者：邓金秀福建医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨C3a对条件永生化温度敏感小鼠足细胞表型转化的影响。方法:分别用0.001μM、0.003μM、0.01μM、0.03μM、0.1μM C3a刺激分化成熟足细胞24小时,用RT-PCR检测synaptopodin、podocin、nephrin、CD2AP、FSP-1、α-SMA、vimentin和I型胶原m RNA的表达。用Western Blot检测nephrin、podocin、CD2AP、FSP-1和α-SMA蛋白的表达。用免疫组化和免疫荧光检测podocin、CD2AP、synaptopodin、FSP-1、vimentin和α-SMA蛋白表达和分布。结果:1、未分化足细胞呈铺路石样外观,37℃无IFN-γ培养7-14天足细胞表达synaptopodin,足细胞分化成熟,细胞变大,并伸出突起。2、免疫组化和免疫荧光:分化成熟足细胞表达synaptopodin、podocin和CD2AP。0.1μM C3a刺激24h后,synaptopodin、podocin和CD2AP表达减少。分化成熟足细胞也有少量FSP-1、α-SMA、vimentin表达,0.1μM C3a刺激24h后,FSP-1、α-SMA和vimentin的表达增加。3、RT-PCR结果:与对照组相比,随着C3a浓度的增加synaptopodin、podocin、CD2AP和nephrin的m RNA表达减少,而FSP-1、α-SMA、vimentin和I型胶原m RNA逐渐增加。随着C3a浓度（0.001-0.1μM）的增加,synaptopodin表达减少（P＜0.05）;（0.003-0.1μM C3a与0.001μM C3a;0.03-0.1μM C3a与0.003-0.01μM C3a相比）synaptopodin表达减少（P＜0.05）。（0.03-0.1μM C3a与0-0.01μM C3a;0.1μM C3a与0.03μM C3a相比）podocin m RNA表达明显减少（P＜0.05）。（0.01-0.1μM C3a与0-0.003μM C3a;0.03-0.1μM C3a与0.01μM C3a;0.1μM C3a与0.03μM C3a相比）CD2AP和nephrin m RNA表达明显减少（P＜0.05）。随着C3a浓度（0.001-0.1μM）的增加FSP-1的表达增加（P＜0.05）;（0.003-0.1μM C3a与0.001μM C3a;0.1μM C3a与0.003-0.03μM C3a）FSP-1 m RNA表达明显增加（P＜0.05）。随着C3a浓度（0.001-0.1μM）的增加α-SMA m RNA表达明显增加（P＜0.05）;（0.003-0.1μM C3a与0.001μM C3a;0.01-0.1μM C3a与0.003μM C3a相比）α-SMA m RNA表达明显增加（P＜0.05）。随着C3a浓度（0.003-0.1μM）的增加vimentin m RNA表达明显增加（P＜0.05）;（0.01-0.1μM C3a与0.003μM C3a相比）vimentin m RNA表达明显增加（P＜0.05）。（0.01-0.1μM C3a与0-0.003μM C3a;0.03μM C3a与0.01μM C3a;0.1μM C3a与0.03μM C3a相比）Collagen I m RNA表达明显增加（P＜0.05）4、Wenstern blot结果:与对照组相比,随着C3a浓度增加,足细胞的podocin、CD2AP和nephrin蛋白表达减少,FSP-1和α-SMA蛋白表达增加。（0.01-0.1μM C3a与对照组;0.03-0.1μM C3a与0.1μM C3a相比）nephrin蛋白表达明显减少（P＜0.05）。随着C3a浓度（0.01-0.1μM）的增加podocin蛋白表达明显减少（P＜0.05）。（0.03-0.1μM C3a与0-0.01μM C3a;0.1μM C3a与0.03μM C3a相比）CD2AP表达明显减少（P＜0.05）。（0.01-0.1μM C3a与对照组;0.1μM C3a与0.01-0.03μM C3a相比）FSP-1表达明显增加（P＜0.05）。（0.01-0.1μMC3a与对照组;0.03-0.1μMC3a与0.01μMC3a相比）α-SMA表达明显减少（P＜0.05）。结论:1、体外培养的成熟足细胞已经发生上皮-间充质细胞转分化。2、补体片段C3a可进一步促进体外培养的小鼠足细胞表型转化,表现为随着C3a浓度的增加nephrin、podocin、CD2AP和synaptopodin的表达减少,而FSP-1、α-SMA,vimentin,I型胶原表达上调。

关键词： C3a 足细胞上皮-间充质细胞转分化

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

活化的巨噬细胞诱导肾小管上皮细胞转分化

活化的巨噬细胞诱导肾小管上皮细胞转分化

作者：杜伟吉林大学

学位级别：硕士

终末期肾脏疾病最为理想及有效的治疗方法是肾移植。近年来，肾移植短期存活率有了明显提高，而肾移植远期存活率仍然不容乐观，移植肾慢性肾功能的丧失最终表现为肾纤维化。肾纤维化的主要病理学特征是肾小管萎缩同时伴有间质纤维组织... 详细信息

终末期肾脏疾病最为理想及有效的治疗方法是肾移植。近年来，肾移植短期存活率有了明显提高，而肾移植远期存活率仍然不容乐观，移植肾慢性肾功能的丧失最终表现为肾纤维化。肾纤维化的主要病理学特征是肾小管萎缩同时伴有间质纤维组织增生。间质纤维组织大量累积是由肌成纤维细胞活化增生引起的，肌成纤维细胞的来源有多个学说，目前研究认为肌成纤维细胞的一个重要来源是肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化，即Epithelial-Mesenchymal Transition（EMT）。有实验表明，T淋巴细胞可以直接破坏肾小管基膜，表现为“小管炎”，并且肾移植排斥时有大量淋巴细胞浸润，因此以前人们都认为主要是T淋巴细胞介导肾移植排斥反应的发生。然而，有研究表明，肾移植排异中，间质也有巨噬细胞浸润，尤其是Banff Ⅰb及以上级别的排异中间质巨噬细胞浸润更多。基于以上研究，我们把目光集中在巨噬细胞上，研究巨噬细胞是否在肾小管上皮细胞的EMT过程中发挥重要作用。目的：本实验采用脂多糖（LPS）体外激活鼠巨噬细胞株J774，然后用其培养上清诱导大鼠肾小管上皮细胞株NRK52E，观察其能否促使NRK52E细胞发生EMT，并通过分析活化巨噬细胞培养基中的细胞因子成分，进一步探讨巨噬细胞在促进EMT发生过程中的相关作用机制。方法：鼠巨噬细胞（J774）分别在含1μg/ml，1.5μg/ml，2.5μg/ml和5μg/ml脂多糖（LPS）的DMEM培养基中体外刺激24小时和48小时，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的情况，并观察用含2.5μg/ml LPS的DMEM培养基刺激24小时后J774的形态改变。将2.5μg/ml的LPS刺激24小时后的巨噬细胞消化离心，并用无血清DMEM培养基洗涤细胞沉淀三次，收集第三次洗涤培养基做对照培养基。然后用无血清DMEM培养基重悬巨噬细胞，继续培养48小时，离心取上清做诱导培养基。将NRK52E分为对照组和诱导组，对照组NRK52E的培养条件为对照培养基和DMEM按2:1混合后加FBS使其最终浓度是5%，诱导组的培养条件为诱导培养基和DMEM按2:1混合后加FBS使其最终浓度是5%。在倒置显微镜下观察培养48小时的对照组和诱导组NRK52E细胞，用Real-Time PCR、Western Blot和免疫细胞化学染色方法检测NRK52E细胞的上皮标记物，如E-钙粘蛋白（E-Ca），细胞角蛋白-19（CK19）和间充质标记物，如α-平滑肌动蛋白（α-SMA），Vimentin。并采用ESI质谱实验检测经LPS（2.5μg/ml）激活24小时的巨噬细胞J774上清中分泌的细胞因子。结果： ELISA检测结果表明，未刺激组巨噬细胞J774用含LPS浓度为0的DMEM培养24小时或48小时后，J774培养上清中均未检测到TNF-α和IL-6的存在。刺激组巨噬细胞J774用含1μg/ml，1.5μg/ml，2.5μg/ml和5μg/ml LPS的DMEM培养基培养24小时或48小时后，J774培养上清中都检测到有明确的TNF-α和IL-6分泌，表明不同浓度的LPS刺激J774作用24小时或48小时，都激活了J774巨噬细胞。但是用低浓度（1μg/ml）LPS刺激48小时与刺激24小时相比， J774上清中TNF-α和IL-6的含量都有下降，因此我们在后续激活巨噬细胞的实验中，选择LPS的刺激时间是24小时。当LPS浓度为2.5μg/ml，刺激巨噬细胞J774作用24小时后，J774培养上清中含有较高浓度的TNF-α和IL-6，因此综合考虑，我们选择LPS激活巨噬细胞的浓度为2.5μg/ml，刺激时间为24小时。后续实验中，用LPS（2.5μg/ml）刺激J774作用24小时，倒置显微镜下发现J774由圆形伸出伪足，煎蛋样贴壁生长。以上结果表明，LPS在体外激活了J774细胞。分别在对照培养条件下和诱导培养条件下培养NRK52E48小时后，与对照组相比，诱导组NRK52E形态发生变化，由连接紧密的铺路石样上皮细胞转化为细胞间隙增大的长梭形间质样细胞。Real-Time PCR结果表明，与对照组细胞相比，诱导组NRK52E的上皮细胞标记物CK19的mRNA表达量降低，是对照组NRK52E的29%，而间充质标记物α-SMA的mRNA表达量上调，是对照组NRK52E的5.6倍。 Western Blot结果表明，与对照组相比，诱导组NRK52E的上皮细胞标记物E-Ca蛋白的表达量明显减少，而间充质细胞标记物Vimentin和α-SMA的表达量都明显增加。免疫细胞化学染色结果也显示，与对照组相比，诱导组NRK52E细胞呈线状表达的上皮细胞标记物E-Ca蛋白的表达量明显降低。以上结果表明，与对照组相比，诱导组NRK52E的上皮细胞标记物在mR

关键词：巨噬细胞肾小管上皮细胞上皮-间充质细胞转分化肾移植排异肾纤维化

高糖刺激对足细胞表型及GSK3β活性的影响

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

高糖刺激对足细胞表型及GSK3β活性的影响

作者：苏晨皓郑州大学

学位级别：硕士

背景糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是导致终末期肾脏病的重要原因,是威胁糖尿病患者生命健康的严重并发症。蛋白尿是DN最常见的临床表现,与DN的严重程度及病情进展密切相关。近年来,肾小球滤过屏障结构和功能的改变,尤其... 详细信息

背景糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是导致终末期肾脏病的重要原因,是威胁糖尿病患者生命健康的严重并发症。蛋白尿是DN最常见的临床表现,与DN的严重程度及病情进展密切相关。近年来,肾小球滤过屏障结构和功能的改变,尤其足细胞损伤在DN蛋白尿发生发展中的作用,已成为了众多学者关注和研究的热点。足细胞贴覆于肾小球基底膜（glomerular basement membrane, GBM）的外壁,是一种高度分化的特殊的上皮细胞,对维持肾小球滤过屏障结构和功能的完整性发挥了关键作用。在某些刺激物的作用下,足细胞可发生上皮—间充质细胞转分化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）,丧失足细胞特异性表型标志物,造成足细胞功能紊乱,最终导致肾小球滤过功能缺失。目前研究认为,主要有三条信号通路介导了足细胞EMT,即TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-catenin通路,糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β, GSK3β）作为以上多条信号通路的参与者,可能在足细胞EMT过程中发挥了重要的作用。目的通过观察高糖刺激下小鼠足细胞是否发生表型的改变,以及GSK3β的表达量和活性的变化,探讨足细胞损伤参与DN蛋白尿形成的可能机制及GSK3β在该过程中的作用,为DN的治疗寻找新的靶点和理论依据。方法以条件永生化小鼠足细胞（MPC-5）为研究对象。 1.高糖刺激对足细胞表型的影响：（1）不同浓度葡萄糖对足细胞表型的影响：用含不同浓度葡萄糖（12.5、25、50mmol/L）的1640培养基处理细胞36h,并设正常对照组（5.6 mmol/L葡萄糖）和高渗对照组（5.6 mmol/L葡萄糖+44.4 mmol/L甘露醇）,采用Western Blot与RT-PCR的方法分别从蛋白及mRNA水平检测足细胞表型标志物nephrin和间充质细胞表型标志物a-SMA的表达;（2）高糖刺激不同时间对足细胞表型的影响：用含25 mmol/L葡萄糖的1640培养基处理细胞,采用Western Blot与RT-PCR的方法分别从蛋白及mRNA水平检测不同时间点（Oh、12h、24h、36h、48h）足细胞nephrin和a-SMA的表达。 2.高糖刺激对足细胞GSK3β活性的影响及其与EMT的关系：按以下方法分组：①正常对照组：用含5.6 mmol/L葡萄糖的1640培养基处理细胞;②高糖组：用含25 mmol/L葡萄糖的1640培养基处理细胞;③高渗对照组：用含5.6 mmol/L葡萄糖+19.4 mmol/L甘露醇的1640培养基处理细胞;④高糖+氯化锂（LiCl）组：用含25mmol/L葡萄糖+20 mmol/L氯化锂（锂离子可选择性抑制GSK3β的活性）的1640培养基处理细胞,36h后采用Western Blot的方法从蛋白水平检测各组细胞nephrin、α-SMA、总GSK3β以及9位丝氨酸位点（抑制位点）磷酸化的GSK3p （pSer9-GSK3p）的表达。结果 1. Western Blot与RT-PCR结果均显示：（1）正常对照组和高渗对照组足细胞表达nephrin,仅少量表达a-SMA,而予不同浓度葡萄糖处理36h后,nephrin的表达水平随葡萄糖浓度的升高呈剂量依赖性下调（P＜0.05）,a-SMA的表达水平随葡萄糖浓度的升高呈剂量依赖性上调（P＜0.05）;（2）高糖环境下足细胞nephrin的表达水平随高糖作用时间的延长呈时间依赖性下调（P＜0.05）,a-SMA的表达水平随作用时间的延长呈时间依赖性上调（P＜0.05）。 2. Western Blot结果显示：正常对照组、高糖组、高渗对照组及高糖+氯化锂组足细胞总GSK3P的表达无显著性差异（P＞0.05）。与对照组相比,高糖组足细胞nephrin表达减少,a-SMA表达增多,pSer9-GSK3p表达减少（即GSK3β活化）,差异均具有统计学意义（P＜0.05）;高糖环境下,用氯化锂抑制GSK3β活性后,足细胞pSer9-GSK3p表达增多,但nephrin表达的减少及a-SMA表达的增多较高糖组反而更加明显,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论 1.在高糖刺激下,足细胞发生向间充质细胞表型的转分化,且nephrin和a-SMA在蛋白及mRNA表达水平的改变呈剂量和时间依赖性。 2.用氯化锂抑制GSK3β的活性后,足细胞反而发生了更加明显的转分化,表明GSK3P的活性可能是维持足细胞正常上皮细胞结构和表型所必需的。 3.在高糖刺激下,足细胞总GSK3β的表达量无显著改变,而是通过磷酸化调节,其活性得到了增强,该现象可能是足细胞在应对高糖刺激时的一种反应性调节,以维持细胞正常

关键词：糖原合成酶激酶3β 足细胞上皮-间充质细胞转分化糖尿病肾病

胸腺细胞诱导NRK52E细胞转分化及对其迁移能力的影响

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

胸腺细胞诱导NRK52E细胞转分化及对其迁移能力的影响

作者：张成斌吉林大学

学位级别：硕士

同种异体肾移植技术已经发展成为了一种治疗各种原因引起的终末期肾脏疾病的最佳方法。在过去的几十年里，移植肾的短期存活率有了显著的提高，然而移植物的长期存活率并没有明显改善。移植肾出现严重的慢性肾功能障碍甚至功能丧失时，... 详细信息

同种异体肾移植技术已经发展成为了一种治疗各种原因引起的终末期肾脏疾病的最佳方法。在过去的几十年里，移植肾的短期存活率有了显著的提高，然而移植物的长期存活率并没有明显改善。移植肾出现严重的慢性肾功能障碍甚至功能丧失时，其主要的病理表现为肾小管萎缩和间质纤维化即移植肾纤维化。文献报道，慢性肾纤维化的形成主要是由于纤维母细胞和/或肌成纤维细胞增生并在间质内分泌过量的细胞外基质引起的，而纤维母细胞和/或肌成纤维细胞的一个重要来源为肾小管上皮细胞向间充质细胞的转分化。临床观察发现，肾移植术后严重的急性排斥反应及其频繁发作可明显缩短移植物纤维化发生的时间。大部分移植肾急性排斥反应属于急性T细胞介导的排斥反应，在病理上主要表现为肾小管上皮细胞内有炎细胞浸润，且炎细胞以T淋巴细胞为主。目前，急性排斥反应影响慢性移植肾纤维化发生的具体机制尚不明确。目的：本实验以肾小管上皮细胞株NRK52E细胞为研究对象，通过体外实验观察大鼠胸腺细胞诱导NRK52E细胞发生上皮-间充质细胞转分化的能力，以及转分化后NRK52E细胞迁移能力的改变。期待为急性排斥反应影响慢性移植肾纤维化发生的机制提供可能的解释。方法：采用ConA（终浓度为5μg/ml）和PHA（终浓度为10μg/ml）体外刺激大鼠胸腺细胞24小时后，倒置显微镜下观察胸腺细胞形态变化，同时用流式细胞术分析胸腺细胞的细胞周期。以及用酶联免疫吸附法检测胸腺细胞分泌IFN-γ和IL-2的情况。将刺激24小时后的胸腺细胞离心，并用无血清DMEM培养基洗涤细胞沉淀三次，收集第三次洗涤培养基做对照培养基。无血清DMEM培养基重悬胸腺细胞，继续培养48小时，离心取上清做诱导培养基。将NRK52E细胞分为对照组和诱导组，两组细胞的孵育条件分别为：45%DMEM培养基+45%对照培养基+10%FBS和45%DMEM培养基+45%诱导培养基+10%FBS。于诱导后24小时在倒置相差显微镜下观察细胞形态，用RT-PCR法、免疫细胞化学染色和免疫荧光染色检测NRK52E细胞的转分化状态。另外通过划痕实验观察诱导后NRK52E细胞迁移能力的改变。结果：经过ConA和PHA联合刺激24小时后，胸腺细胞体积增大，直径由14.00±1.2μm增加至20.36±2.1μm（P＜0.05），细胞增殖指数也由对照组的19.23％±2.37％增加至刺激组的27.45%±1.77％（P＜0.05）。刺激48小时后胸腺细胞分泌干扰素-γ的量由633.5±18.3pg/ml升高至791±26.7pg/ml（P＜0.05），而IL-2的分泌量在刺激24、48和72小时后，分别由4352.65±67.1pg/ml、4241.5±56.2pg/ml、4673.5±87.9pg/ml升高至5531.79±40.2pg/ml、5267.45±31.7pg/ml、5387.1±89.2pg/ml，（P＜0.05）。以上结果提示，ConA和PHA的联合刺激促进了胸腺细胞的增殖、活化和细胞因子的分泌。形态观察发现，经过诱导培养基诱导24小时后，诱导组NRK52E细胞变为间充质细胞样的长梭形，细胞间隙变大，排列稀疏。RT-PCR结果显示，诱导后NRK52E细胞E-Ca表达下降，mRNA的相对表达量由0.764±0.032下降至0.214±0.025（P＜0.05）;而α-SMA表达升高，mRNA的相对表达量由0.56±0.031升高至0.647±0.021（P＜0.05）。此外免疫细胞化学染色和免疫荧光染色均发现，诱导后NRK52E细胞上皮细胞标记物E-Ca和CK-19表达下降而间充质细胞标记物α-SMA和Vimentin表达升高。划痕试验还发现，诱导后NRK52E细胞迁移能力增加，相对迁移率由对照组的62.1%±6.0%增加至诱导组的83.0%±2.8%（P＜0.05）。结论：大鼠胸腺细胞能诱导体外培养的肾小管上皮细胞发生上皮-间充质细胞转分化，且转分化后的肾小管上皮细胞的体外迁移能力增加。

关键词：慢性移植肾肾病急性排斥反应上皮-间充质细胞转分化胸腺细胞

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

糖尿病肾病大鼠足细胞转分化特征研究

四川医学 2017年第11期38卷 1238-1241页

作者：张嬿叶学锋詹华奎涂翔吕春燕成都中医药大学附属医院西内教研室糖尿病基地办病理科四川成都610075

目的观察糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)大鼠足细胞上皮细胞及间充质细胞标志物的变化,揭示DN大鼠足细胞转分化特征。方法分别应用免疫组织化学、实时定量PCR检测DN大鼠足细胞WT1、P-Cadherin、Desmin的阳性面积比、积分光密度及m... 详细信息

目的观察糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)大鼠足细胞上皮细胞及间充质细胞标志物的变化,揭示DN大鼠足细胞转分化特征。方法分别应用免疫组织化学、实时定量PCR检测DN大鼠足细胞WT1、P-Cadherin、Desmin的阳性面积比、积分光密度及mRNA的表达,并与正常大鼠作对照;同时将DN组大鼠24h尿蛋白定量与上述各指标积分光密度进行相关性分析。结果与正常大鼠比较,DN组大鼠WT1下降,但差异无统计学意义(P>0.05);P-Cadherin降低,差异有统计学意义(P0.05),与P-Cadherin积分光密度呈负相关(r=-0.600,P细胞数目尚未减少时,可能已经发生了上皮-间充质细胞转分化,而尿蛋白的发生与此有一定的相关性。

关键词：糖尿病肾病足细胞表型转化上皮-间充质细胞转分化