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林麝源化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌三重实时荧光定量pcr检测方法的建立

动物医学进展 2020年第12期41卷 23-27页

作者：唐婕刘二龙周建文杨超索丽娟边坤蒋本模王艳陕西省动物研究所陕西西安710032 黄埔出入境检验检疫技术中心广东广州510730 凤县林业局留凤关林场陕西凤县721707 宝鸡市林麝工程技术研究中心陕西宝鸡721702 凤县逢春济民可信科技养殖有限公司陕西凤县721702

为快速准确检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌,分别根据化脓隐秘杆菌plo基因、溶血性曼氏杆菌ICEMh1基因和肺炎链球菌pspC基因的特异性序列设计引物和探针,以重组质粒a.p-m.h1-s.p为标准品,通过优化反应条件,建立一种检测... 详细信息

为快速准确检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌,分别根据化脓隐秘杆菌plo基因、溶血性曼氏杆菌ICEMh1基因和肺炎链球菌pspC基因的特异性序列设计引物和探针,以重组质粒a.p-m.h1-s.p为标准品,通过优化反应条件,建立一种检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌三重实时荧光定量pcr方法,对其特异性、灵敏度和可重复性进行测试。结果表明,建立的方法对标准品阳性质粒的最低检测量为20拷贝,标准曲线在1.25×10^6 copies/μL^1.0×101 copies/μL范围内具有良好的线性关系。对2016年-2018年在陕西省收集的病料中化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌检出率分别为66.67%、5.5%和44.44%。建立的三重实时荧光定量pcr方法能快速、准确和稳定地检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌。

关键词：林麝化脓隐秘杆菌溶血性曼氏杆菌肺炎链球菌三重实时荧光定量pcr

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基于全自动核酸提取的荧光定量pcr鉴别羊肉制品真伪

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食品安全质量检测学报 2022年第10期13卷 3148-3155页

作者：柳梦思时国强卢鑫张伟石磊河北三狮生物科技有限公司石家庄050035 河北农业大学生命科学学院保定071000

目的建立一种基于自动化的快速核酸提取方法,联合三重实时荧光定量pcr技术,鉴别羊肉制品的真伪。方法分别采用全自动核酸提取法、磁珠手提法与柱提法对不同状态羊肉制品进行核酸提取,比较不同方法的提取时间差异,通过三重实时荧光定量PC... 详细信息

目的建立一种基于自动化的快速核酸提取方法,联合三重实时荧光定量pcr技术,鉴别羊肉制品的真伪。方法分别采用全自动核酸提取法、磁珠手提法与柱提法对不同状态羊肉制品进行核酸提取,比较不同方法的提取时间差异,通过三重实时荧光定量pcr扩增结果评估不同方法的提取效果。以GB/T38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光pcr法》为对照,对市售的羊肉制品进行平行检测,评估本方法的检测性能。结果与磁珠手提法、柱提法相比,全自动核酸提取法的提取时间缩短了15~30 min,且提取的核酸扩增效果更好。全自动核酸提取法在羊猪混合样品中羊源核酸检出限为0.010mg/g。全自动核酸提取法在生鲜肉、生肉及熟肉制品等多种类型产品中提取的羊源核酸pcr检测结果的变异系数(coefficient of variation,CV)均小于3.000%。分别采用三重实时荧光定量pcr法与GB/T38164—2019对全自动提取的21份市售的涵盖不同类型的羊肉制品核酸进行平行检测,符合率为100.00%。结论本研究方法可为羊肉制品掺假的快速真伪鉴别提供操作简便、稳定灵敏、快速准确的整套解决方案。

关键词：全自动核酸提取磁珠法羊肉真伪鉴别三重实时荧光定量pcr

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PPV、PRV和PCV-2三重pcr与PCV-2 LAMP检测方法的建立及初步应用

PPV、PRV和PCV-2三重PCR与PCV-2 LAMP检测方法的建立及初步应用

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作者：申世川南京农业大学

学位级别：硕士

本研究应用pcr技术和TaqMar(?)探针实时荧光定量pcr技术,建立猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)单项与三重二温式pcr快速检测方法及单项与三重实时荧光定量pcr (FQ-pcr)方法;探索应用环介导等温扩增(LAMP)技术... 详细信息

本研究应用pcr技术和TaqMar(?)探针实时荧光定量pcr技术,建立猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)单项与三重二温式pcr快速检测方法及单项与三重实时荧光定量pcr (FQ-pcr)方法;探索应用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立简单、灵敏、特异的PCV-2检测方法。所建立检测技术为实验室快速检测上述猪主要DNA病毒提供了可靠的方法,研究分为三个部分：和PCV-2单项及三重二温式pcr方法的建立PPV、PRV一、通过对GenBank登录的PPV、PRV和PCV-2核苷酸序列比对分析,选出PPV的VP2基因、PRV的gH基因和PCV-2的ORF2基因为相对保守区域,利用生物学软件筛选设计出3对高熔解温度特异性引物,目的片段大小分别为142bp(PPV)、300bp (PRV)和469bp (PCV-2)。经条件优化、敏感性试验、特异性试验及重复性试验,建立了单项与三重二温式pcr检测方法。整个三重二温式pcr反应过程约需66min,比三个常规单项pcr分别检测所用总时间减少了近70%,比常规三重pcr节省了至少20%的时间;对三者阳性质粒的检出敏感性低至200拷贝;对其它猪常见病原(副猪嗜血杆菌、链球菌、CSFV、PRRSV、大肠杆菌和JEV)检测无交叉反应;有较好的重复性和稳定性。二、PPV、 PRV和PCV-2单项与三重FQ-pcr检测方法的建立根据TaqMan(?)探针实时荧光定量pcr原理,运用引物、探针设计软件对PPV的VP2基因、PRV的gH基因及PCV-2的ORF2基因分别设计一对引物和一条特异性探针,探针报告集团依次为：JOE (PPV)、TAMARA (PRV)和FAM (PCV-2)。经条件优化、敏感性试验、特异性试验及批内批间重复试验,建立了单项与三重FQ-pcr检测方法。整个反应过程在70min内完成;对阳性质粒的检出敏感性低至10拷贝;对其它猪常见病原检测无交叉反应;批内批间重复试验CV%均小于3%,具有良好重复性;扩增效率E>95%,标准曲线R2>0.99,具有良好的线性关系。三、PCV-2LAMP检测方法的建立根据LAMP技术原理,选取PCV-2的ORF2基因,利用在线Primer Explorer3.0软件设计4条特异性引物。经条件优化、敏感性试验和特异性试验,建立了PCV-2LAMP检测方法。该方法对PCV-2基因组DNA的检出敏感性达0.5pg;对其它猪常见病原检测无交叉反应;阳性扩增产物经酶切验证,为预期条带;反应产物中加入SYBR Green Ⅰ染料,可根据颜色变化,肉眼快速判断结果。用所建立三联pcr方法对205份临床疑似病料样品进行检测,分别与常规单项pcr方法对比。结果显示,单项和三重二温式pcr方法对PPV、PRV和PCV-2检测结果与常规单项pcr方法的总符合率均在97%以上;单项和三重实时荧光定量pcr方法对各相关病原检出率均高于常规单项pcr方法：PPV高出0.38%,PRV高出0.97%,PCV-2高出1.96%。用所建立PCV-2LAMP方法对30份经国标PCV-2检测方法鉴定为阳性的病料DNA进行检测,均能扩增出梯状条带,且阴性对照无扩增,验证了方法的可靠性。

关键词：猪 PPV PRV PCV-2 二温式pcr 三重实时荧光定量pcr LAMP

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