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胚自主发生基因在一系法杂交稻中的应用研究

胚自主发生基因在一系法杂交稻中的应用研究

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作者：王耀湖南大学

学位级别：硕士

一系法培育不分离、固定杂种优势的F后代,免除了重复繁琐的杂交制种过程,是杂交水稻育种重要发展方向之一。而无融合生殖是实现一系法主要的途径。利用无融合生殖技术,通过种子进行无性生殖,使杂交品种的基因型随着世代更迭但杂合基因... 详细信息

一系法培育不分离、固定杂种优势的F后代,免除了重复繁琐的杂交制种过程,是杂交水稻育种重要发展方向之一。而无融合生殖是实现一系法主要的途径。利用无融合生殖技术,通过种子进行无性生殖,使杂交品种的基因型随着世代更迭但杂合基因型不发生变化。后代群体也不出现性状分离,保持优良的杂种优势稳定遗传。本研究首先设计了一种以诱导不定胚发生的方式实现杂交水稻无融合繁殖的新体系,其次利用组成型启动子Ubiq驱动胚自主发生基因BBM1,分析BBM1基因在水稻中的表达情况;最后将卵细胞特异启动子AtDD45驱动BBM1基因表达盒,构建到PAIR1、REC8和OSD1（Mi Me）的基因编辑载体,诱导水稻无融合生殖的二倍体克隆种子。主要研究结果如下:（1）将由胚珠特异性启动子驱动的胚自主发生基因AtWUS,由卵细胞特异性启动子AtDD45驱动的核糖核酸酶基因Barnase和由花粉特异性启动子p G47驱动的致死基因Zm AA1同时整合到一个T-DNA中,并与携带Barstar基因的第二个T-DNA共转化。通过对转基因株系后代种子催芽观察,在不同株系中均发现双胚苗现象。通过流式细胞术的倍性水平鉴定和全基因组测序杂合度分析显示,双胚苗的一个单株为杂合二倍体,另一个单株为纯合单倍体,这证实了双胚苗的一个胚胎来自于受精后的受精卵,另一个胚胎来自未受精的配子,表明胚自主发生基因AtWUS在胚囊的其他细胞中异位表达产生单倍体。同时通过对种子表型分析,在转化株系T代中获得无胚种子的概率为2.6%-3.8%,在T代获得无胚种子的概率为0.75%-3%。无胚种子胚乳DNA的PCR检测结果表明,无胚种子的形成与Barnase致死基因相关,这也表明水稻胚乳的发育是自主进行的过程。通过基因组型分析将转基因植株与野生型杂交稻基因型序列比对,结果显示后代群体的基因组中都不包含野生型杂交稻的杂合基因型,这表明后代中没有出现固定杂种优势的体细胞胚种子。（2）将组成型启动子Ubiq驱动的胚自主发生基因BBM1表达盒构建至骨架载体p LJ02后转入杂交稻甬优4949中,分析胚自主发生基因在水稻中的表达情况。通过红色荧光标记基因对转化植株种子荧光分选后,T代植株进行流式细胞术倍性水平鉴定及基因芯片靶向测序分析,在流式细胞倍性检测中发现单倍体植株,而在靶向测序中既发现单倍体植株,也发现双单倍体（纯合体）植株,这表明胚自发基因BBM1能在胚囊中异位表达。（3）将卵细胞特异启动子AtDD45驱动的胚自主发生基因BBM1表达盒构建至PAIR1、REC8和OSD1（Mi Me）的基因编辑载体后转入杂交稻甬优4949中,以诱导二倍体克隆种子。对T代BBM1阳性的转化植株做靶标测序,筛选出Mi Me三突材料,通过流式细胞倍性鉴定获得二倍体克隆种子诱导率为95.24%的转化株系。基因芯片靶向测序结果表明克隆种子与野生型对照杂合度一致,靶标测序结果与T代母本一致,这表明胚自主发生基因BBM1在卵细胞特异启动子AtDD45驱动下,结合Mi Me策略,可诱导出高频率的无融合生殖。

关键词：一系法杂交稻无融合生殖无胚种子克隆种子

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胚特异启动子的鉴定及在一系法杂交稻的创制中的应用

胚特异启动子的鉴定及在一系法杂交稻的创制中的应用

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作者：卜小兰湖南大学

学位级别：硕士

水稻种子与人类生活息息相关,也是基因改良的重要目标材料,启动子作为水稻种子遗传改良工作中一个重要的分子工具,在基因转录起始过程中有高效调控功能,其中胚特异性启动子不仅决定了外源基因在特定组织、发育阶段的表达,还有效避免了... 详细信息

水稻种子与人类生活息息相关,也是基因改良的重要目标材料,启动子作为水稻种子遗传改良工作中一个重要的分子工具,在基因转录起始过程中有高效调控功能,其中胚特异性启动子不仅决定了外源基因在特定组织、发育阶段的表达,还有效避免了外源基因在水稻其他器官或组织表达,造成能源消耗等不利影响。因此,了解胚特异性启动子在水稻种子中的表达特征及作用机制,鉴定并获得高效专一的种胚特异性启动子,有利于研究外源基因在水稻种胚中的表达,对于改良水稻品质有重要理论和实践意义。本实验筛选了三个胚特异性启动子OsESP1、p EMB1和Ole18,分别连接到含红色荧光蛋白（RFP）报告基因的载体p LJ02上构建双荧光融合表达载体。利用基因枪介导的瞬时表达结合农杆菌介导的稳定表达,通过荧光观察,鉴定三个胚特异启动子的特异表达模式,选出在水稻胚中特异性较好的启动子,将其应用到一系法杂交稻的创制中。主要结果如下:（1）从NCBI网站上获得OsESP1、pEMB1和Ole18启动子序列,构建含有GFP和RFP的融合表达载体p26P1、p26P2、p26P3。构建组成型启动子Ca MV 35S驱动e GFP表达的融合表达载体p26GR,作为e GFP阳性对照。交由公司构建,提取载体大肠杆菌质粒并进行验证,酶切片段大小符合预期,表明载体构建正确;将表达载体分别转入农杆菌感受态中,提取载体农杆菌质粒并酶切验证,片段大小符合预期,鉴定为阳性克隆菌液,可用于农杆菌侵染。（2）使用基因枪瞬时转化法,分别将p26GR、p26P1、p26P2、p26P3表达载体转化到水稻成熟胚中,每个载体转化三批成熟胚。将转化后获得的材料在荧光体式显微镜下观察,结果表明四个表达载体均已转入成熟胚中,但均未能驱动绿色荧光的表达;进一步进行基因枪转化实验,以水稻幼胚为受体材料转化四个表达载体,每个载体转化三批幼胚。在荧光体式显微镜下观察转化后的幼胚材料,实验结果表明启动子Ole18可驱动外源基因在水稻幼胚中表达。（3）将验证为阳性菌液的农杆菌通过农杆菌介导法转入水稻品种日本晴,p26GR、p26P1、p26P2、p26P3表达载体各获得18、23、26、20株T1代转化植株,取叶片进行PCR检测,结果表明部分表达载体已转入植株中,将确定为阳性克隆的植株移栽至大田培养直至收获T0代种子,观察表达载体的T0代种子各部分荧光表达情况,发现p26P1和p26P3种子胚部分有绿色荧光表达,结果表明Os ESP1和Ole18是专一的胚特异性启动子。（4）结合基因枪瞬时转化和农杆菌稳定转化的结果,选取表达高效且专一的胚特异性启动子Ole18,构建胚特异表达的红色荧光抑制表达盒E1,和花粉特异表达启动子驱动针对E1表达的调控表达盒E2和胚自主发生表达盒E3一同转入p24Mi Me合成p24DB,以此分选出无融合种子,实现水稻胚特异性启动子在一系法杂交稻创制中的应用。

关键词：胚特异启动子基因克隆荧光报告基因一系法杂交稻

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