胚自主发生基因在一系法杂交稻中的应用研究

作     者：王耀 

作者单位：湖南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曹孟良

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：一系法杂交稻 无融合生殖 无胚种子 克隆种子 

摘      要：一系法培育不分离、固定杂种优势的F后代,免除了重复繁琐的杂交制种过程,是杂交水稻育种重要发展方向之一。而无融合生殖是实现一系法主要的途径。利用无融合生殖技术,通过种子进行无性生殖,使杂交品种的基因型随着世代更迭但杂合基因型不发生变化。后代群体也不出现性状分离,保持优良的杂种优势稳定遗传。本研究首先设计了一种以诱导不定胚发生的方式实现杂交水稻无融合繁殖的新体系,其次利用组成型启动子Ubiq驱动胚自主发生基因BBM1,分析BBM1基因在水稻中的表达情况;最后将卵细胞特异启动子AtDD45驱动BBM1基因表达盒,构建到PAIR1、REC8和OSD1（Mi Me）的基因编辑载体,诱导水稻无融合生殖的二倍体克隆种子。主要研究结果如下: （1）将由胚珠特异性启动子驱动的胚自主发生基因AtWUS,由卵细胞特异性启动子AtDD45驱动的核糖核酸酶基因Barnase和由花粉特异性启动子p G47驱动的致死基因Zm AA1同时整合到一个T-DNA中,并与携带Barstar基因的第二个T-DNA共转化。通过对转基因株系后代种子催芽观察,在不同株系中均发现双胚苗现象。通过流式细胞术的倍性水平鉴定和全基因组测序杂合度分析显示,双胚苗的一个单株为杂合二倍体,另一个单株为纯合单倍体,这证实了双胚苗的一个胚胎来自于受精后的受精卵,另一个胚胎来自未受精的配子,表明胚自主发生基因AtWUS在胚囊的其他细胞中异位表达产生单倍体。同时通过对种子表型分析,在转化株系T代中获得无胚种子的概率为2.6%-3.8%,在T代获得无胚种子的概率为0.75%-3%。无胚种子胚乳DNA的PCR检测结果表明,无胚种子的形成与Barnase致死基因相关,这也表明水稻胚乳的发育是自主进行的过程。通过基因组型分析将转基因植株与野生型杂交稻基因型序列比对,结果显示后代群体的基因组中都不包含野生型杂交稻的杂合基因型,这表明后代中没有出现固定杂种优势的体细胞胚种子。 （2）将组成型启动子Ubiq驱动的胚自主发生基因BBM1表达盒构建至骨架载体p LJ02后转入杂交稻甬优4949中,分析胚自主发生基因在水稻中的表达情况。通过红色荧光标记基因对转化植株种子荧光分选后,T代植株进行流式细胞术倍性水平鉴定及基因芯片靶向测序分析,在流式细胞倍性检测中发现单倍体植株,而在靶向测序中既发现单倍体植株,也发现双单倍体（纯合体）植株,这表明胚自发基因BBM1能在胚囊中异位表达。 （3）将卵细胞特异启动子AtDD45驱动的胚自主发生基因BBM1表达盒构建至PAIR1、REC8和OSD1（Mi Me）的基因编辑载体后转入杂交稻甬优4949中,以诱导二倍体克隆种子。对T代BBM1阳性的转化植株做靶标测序,筛选出Mi Me三突材料,通过流式细胞倍性鉴定获得二倍体克隆种子诱导率为95.24%的转化株系。基因芯片靶向测序结果表明克隆种子与野生型对照杂合度一致,靶标测序结果与T代母本一致,这表明胚自主发生基因BBM1在卵细胞特异启动子AtDD45驱动下,结合Mi Me策略,可诱导出高频率的无融合生殖。