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半理性设计进化土曲霉来源的ω-转氨酶AtTA热稳定性

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生物工程学报 2023年第6期39卷 2126-2140页

作者：蔡婷婷曹佳仁邱帅吕常江樊芳芳胡升赵伟睿梅乐和黄俊浙江科技学院生物与化学工程学院浙江杭州310023 浙大宁波理工学院生物与化学工程学院浙江宁波315100 浙江大学化学工程与生物工程学院浙江杭州310027 金华高等研究院浙江金华321019

转氨酶(ω-transaminase,ω-TA)作为一种天然的生物催化剂,在手性胺类化合物的合成中具有较好的应用前景。但ω-TA在催化非天然底物的反应过程中存在稳定性差、活性低的缺陷,大大限制了ω-TA的应用。为改善此缺陷,针对来源于土曲霉(Aspe... 详细信息

转氨酶(ω-transaminase,ω-TA)作为一种天然的生物催化剂,在手性胺类化合物的合成中具有较好的应用前景。但ω-TA在催化非天然底物的反应过程中存在稳定性差、活性低的缺陷,大大限制了ω-TA的应用。为改善此缺陷,针对来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的(R)-ω-TA(At TA),采用基于分子动力学模拟的计算机辅助设计与随机突变、组合突变相结合的策略进行酶的热稳定性改造,获得了热稳定性与活性同步提高的最佳突变酶At TA-E104D/A246V/R266Q(M3)。与At TA野生酶(wild-type,WT)相比,M3的半衰期t1/2(35℃)由17.8 min提升至102.7 min,提升了4.8倍,半失活温度T5010比WT(38.1℃)提高2.2℃。最佳突变酶M3对丙酮酸和1-(R)-苯乙胺的催化效率分别是野生酶的1.59倍和1.56倍。分子动力学模拟与分子对接结果表明,分子内氢键与疏水相互作用的增加所导致α-螺旋的加固稳定是酶热稳定性提升的主要原因;底物分子与结合口袋氨基酸之间氢键相互作用的增加以及底物结合口袋体积的增大是导致M3催化效率提升的主要原因。底物谱测定结果表明,相较于WT,M3对11种芳香酮类化合物的催化性能均有所提升,进一步说明M3对手性胺的合成具有更高的应用价值。

关键词：手性胺 ω-转氨酶热稳定性半理性设计分子动力学模拟 α-螺旋

巨大芽孢杆菌ω-转氨酶催化合成手性β-氨基醇

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高校化学工程学报 2021年第6期35卷 1035-1040页

作者：杨晓晓李静张朝峰常宏宏张建栋太原理工大学生物医学工程学院山西太原030024

针对目前用于合成手性β-氨基醇的(S)-转氨酶稀缺的问题,对来自巨大芽孢杆菌(Bacillus Megaterium SC6394)的(S)-ω-转氨酶(BMTA)基因密码子进行优化,在大肠杆菌中成功表达,并对BMTA进行纯化表征。结果表明:BMTA对(R)-β-氨基醇具有较... 详细信息

针对目前用于合成手性β-氨基醇的(S)-转氨酶稀缺的问题,对来自巨大芽孢杆菌(Bacillus Megaterium SC6394)的(S)-ω-转氨酶(BMTA)基因密码子进行优化,在大肠杆菌中成功表达,并对BMTA进行纯化表征。结果表明:BMTA对(R)-β-氨基醇具有较高活力,对(S)-β-氨基醇没有活力;BMTA在pH为7.5、温度为55℃下酶活最高,在pH为6.5~8.0,温度为4~30℃内具有较好的稳定性。应用BMTA对不同外消旋β-氨基醇进行动力学拆分,底物转化率高达50%,对映体过量值(ee)为50%~99%。应用BMTA不对称还原胺化不同α-羟基酮,产物(R)-β-氨基醇转化率高达58%~96%,ee>99%。

关键词： ω-转氨酶手性β-氨基醇羟酮动力学拆分不对称还原胺化

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一种新型ω-转氨酶的工业适应性选择

生物工程学报 2020年第9期36卷 1929-1938页

作者：王继国谢有余王华磊魏东芝华东理工大学生物工程学院上海200237

尽管ω-转氨酶被认为是手性胺合成中极具工业潜力的生物催化剂,但是由于受限于酶的热不稳定及不利的反应平衡,能直接适用于工业的野生酶极少。为了发现工业适应潜力的新型ω-转氨酶,文中设计了包括底物、序列、克隆、酶活、转化率及酶... 详细信息

尽管ω-转氨酶被认为是手性胺合成中极具工业潜力的生物催化剂,但是由于受限于酶的热不稳定及不利的反应平衡,能直接适用于工业的野生酶极少。为了发现工业适应潜力的新型ω-转氨酶,文中设计了包括底物、序列、克隆、酶活、转化率及酶学的工业适应性选择流程,并对各筛选步骤中存在的问题进行了研究,进而从土壤宏基因组中筛选出了一种来源于柄杆菌属的新型ω-转氨酶ATA-W12,以异丙胺为供体在1mL反应体系中转化了85.84%1-Boc-3-吡咯烷酮(20 mmol/L)和67.42%1-Boc-3-哌啶酮(20 mmol/L)。酶学筛选发现,ATA-W12在40℃孵育168 h活力维持不变;优选反应条件为pH 8.5、40℃;这些特征利于工业用理想氨基供体异丙胺的使用。笔者已采用ATA-W12实现了100g/L光学纯(S)-(+)-1-Boc-3-氨基哌啶的50mL实验室规模制备,为进一步工业化生产打下基础。

关键词：手性胺合成 ω-转氨酶异丙胺适应性选择

随机-半理性组合突变改造ω-转氨酶催化合成(R)-1-(1-萘基)乙胺

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生物工程学报 2020年第9期36卷 1828-1837页

作者：曹旭东韩瑞枝方红辉倪晔江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

(R)-1-(1-萘基)乙胺是合成拟钙剂药物盐酸西那卡塞的关键手性中间体,利用ω-转氨酶不对称还原1-萘乙酮合成(R)-1-(1-萘基)乙胺具有较好的应用前景。文中针对节杆菌属Arthrobacter sp.来源的ω-转氨酶,采用随机突变和半理性设计相结合的... 详细信息

(R)-1-(1-萘基)乙胺是合成拟钙剂药物盐酸西那卡塞的关键手性中间体,利用ω-转氨酶不对称还原1-萘乙酮合成(R)-1-(1-萘基)乙胺具有较好的应用前景。文中针对节杆菌属Arthrobacter sp.来源的ω-转氨酶,采用随机突变和半理性设计相结合的策略,获得了催化效率和热稳定性提高的突变酶F225M、C281I和F225M/C281I。与WT相比,双突变体F225M/C281I的kcat提高85%,Km下降56%,催化效率kcat/Km提高3.42倍。此外,F225M/C281I催化10mmol/L1-萘乙酮反应24h的转化率提高了22%。分子对接和分子动力学模拟结果表明,F225M/C281I相比于WT增加了与底物1-萘乙酮之间的Pi-Pi相互作用力,导致其催化效率的提高;而且突变酶F225M/C281I的134–139位点残基的均方根波动(RMSF)相比WT明显降低,与半衰期的略微提高相关。

关键词： ω-转氨酶随机突变半理性设计 1-萘乙酮 (R)-1-(1-萘基)乙胺

删除Loop区域表面不稳定氨基酸提高(R)-ω-转氨酶热稳定性

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生物工程学报 2017年第12期33卷 1923-1933页

作者：谢东芳吕常江方卉杨卫康胡升赵伟睿黄俊梅乐和浙江科技学院生物与化学工程学院浙江杭州310023 浙江大学宁波理工学院生物与化学工程学院浙江宁波315100

手性胺是一类具有重要价值的医药及精细化工中间体,如何实现手性胺类化合物的不对称合成是目前人们普遍关注的一个焦点问题。ω-转氨酶(ω-Transaminase,ω-TA)是一类能直接合成对映体手性胺的天然生物催化剂。相比于(S)-ω-TA,(R)-ω-T... 详细信息

手性胺是一类具有重要价值的医药及精细化工中间体,如何实现手性胺类化合物的不对称合成是目前人们普遍关注的一个焦点问题。ω-转氨酶(ω-Transaminase,ω-TA)是一类能直接合成对映体手性胺的天然生物催化剂。相比于(S)-ω-TA,(R)-ω-TA的研究较少,但其需求量随着手性胺类药物的发展日趋增大。提高具有潜在应用价值的(R)-ω-TA的热稳定性,将有利于手性胺的制备。本文利用Py MOL软件和YASARA软件预测来源于土曲霉Aspergillus terreus的(R)-ω-TA中具有高温度因子(B-factor)的Loop区域,通过定点突变对Loop区域表面不稳定氨基酸逐步进行删除获得突变酶。结果表明,突变酶R131del和突变酶P132-E133del半失活温度分别为41.1℃和39.4℃,比野生酶提高了2.6℃和0.9℃;在40℃下的半衰期分别为15.0 min和10.0 min,为野生酶的2.2倍和1.5倍。此外,在400 K和10 ns的分子模拟条件下,突变酶R131del在Loop区域的均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)比野生型低,突变酶P132-E133del在Loop区域增加了4个氢键。本研究通过删除(R)-ω-转氨酶Loop区域表面不稳定氨基酸提高了该蛋白的热稳定性,同时也为其他酶热稳定性的理性设计提供了方法学指导。

关键词：手性胺 ω-转氨酶 B-factor Loop区域均方根涨落热稳定性

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ω-转氨酶分子改造研究进展

生物工程学报 2018年第7期34卷 1057-1068页

作者：高新星韦平和泰州学院医药与化学化工学院江苏省手性医药化学品生物制造重点建设实验室江苏泰州225300

ω-转氨酶能催化羰基化合物发生不对称还原胺化反应,在制备手性胺类化合物方面具有较好的应用前景。由于底物结合区域特殊的空间结构,野生型ω-转氨酶在合成大位阻手性胺方面的应用受到了限制。此外,在立体选择性和稳定性方面这一类酶... 详细信息

ω-转氨酶能催化羰基化合物发生不对称还原胺化反应,在制备手性胺类化合物方面具有较好的应用前景。由于底物结合区域特殊的空间结构,野生型ω-转氨酶在合成大位阻手性胺方面的应用受到了限制。此外,在立体选择性和稳定性方面这一类酶也存在一些不足,目前满足工业应用需求的ω-转氨酶仍较为有限。文中首先介绍了ω-转氨酶的结构特征和催化机制,并探讨S型和R型酶在结构特征方面的主要差异。然后对ω-转氨酶的分子改造研究进行了综述,重点阐述了基于结构特征和催化机制进行的分子改造研究,包括底物特异性改造、立体选择性改造和稳定性改造三方面。最后,对ω-转氨酶分子改造研究进展进行总结和展望。

关键词： ω-转氨酶结构分子改造底物特异性稳定性

一种来源于Burkholderia phytofirmans PsJN的ω-转氨酶的表达纯化及性质分析

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生物工程学报 2016年第7期32卷 912-926页

作者：杜允成董文玥姜进举陈启佳冯进辉吴洽庆朱敦明中国科学院天津工业生物技术研究所工业酶国家工程实验室天津300308 中国科学院大学北京100049

ω-转氨酶(ω-transaminase)可以通过手性拆分和不对称合成的催化反应来获得光学纯的手性胺类化合物和非天然氨基酸,在医药中间体合成中是一种重要的生物催化剂。采用基因挖掘技术,在基因组数据库中获得一个来自伯克氏菌Burkholderia ph... 详细信息

ω-转氨酶(ω-transaminase)可以通过手性拆分和不对称合成的催化反应来获得光学纯的手性胺类化合物和非天然氨基酸,在医药中间体合成中是一种重要的生物催化剂。采用基因挖掘技术,在基因组数据库中获得一个来自伯克氏菌Burkholderia phytofirmans Ps JN的ω-转氨酶基因(hbp),将该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中克隆、表达,利用镍柱亲和层析将该酶(HBP)进行纯化并研究了其酶学性质和底物谱。结果表明,以β-苯丙氨酸(β-Phe)为氨基供体、丙酮酸为氨基受体,HBP具有较高的活力(33.80 U/mg)和立体选择性;其最适温度为40℃左右,最适p H在8.0–8.5之间。研究过程中,建立了一种简便快捷的紫外吸收法来检测β-Phe的脱氨反应,证明了该反应的热力学平衡性质。底物谱研究表明HBP可以以β-Phe及其衍生物为氨基供体。结果表明HBP能够有效地手性拆分rac-β-Phe及其衍生物,转化率在50%左右,ee>99%。

关键词： ω-转氨酶伯克氏菌芳香族β-氨基酸手性拆分

工程化ω-转氨酶催化手性环氨基醇合成的研究

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工程化ω-转氨酶催化手性环氨基醇合成的研究

作者：蒋丹阳太原理工大学

学位级别：硕士

手性环氨基醇在制药上是一类非常重要的化合物,可作为手性砌块和手性中间体用于合成重要药物活性分子。然而手性环氨基醇的合成仍面临巨大挑战。化学法合成手性环氨基醇具有选择性低、催化剂昂贵、易造成环境污染等问题。转氨酶因其反... 详细信息

手性环氨基醇在制药上是一类非常重要的化合物,可作为手性砌块和手性中间体用于合成重要药物活性分子。然而手性环氨基醇的合成仍面临巨大挑战。化学法合成手性环氨基醇具有选择性低、催化剂昂贵、易造成环境污染等问题。转氨酶因其反应条件温和、基团无需保护﹑催化效率高﹑且无需辅酶循环再生等优点,被广泛用于手性胺﹑手性氨基醇和手性氨基酸的合成。然而应用转氨酶催化手性环氨基醇的合成却鲜有报道。先前研究发现来自分枝杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)(R)-ω-转氨酶(MVTA)对链状邻氨基醇和芳香族邻氨基醇具有较高活性和极好选择性,但对邻位环氨基醇活性却非常低。本研究拟对MVTA进行定向进化改造,通过随机突变和定点饱和突变策略,结合构建的高通量筛选方法,最终筛选获得高活力、高选择性突变酶MVTA＿L202K,对该酶进行了纯化表征;通过该突变酶对外消旋环氨基醇进行了动力学拆分,对α-羟酮进行了不对称还原胺化;最后通过构建的环氧化物水解酶、醇脱氢酶和转氨酶一锅煮级联催化体系,成功对环己烯氧化物进行了不对称开环合成了单一构型的(1R,1R)-2-氨基环己醇。本研究对转氨酶的定向改造具有一定的理论借鉴意义,为手性环氨基醇的绿色合成提供了一条新的途径,具有潜在工业应用价值。首先,考察了野生酶MVTA对反式-2-氨基环己醇的催化活性,结果显示该酶对(1S,2S)-2-氨基环己醇无催化活性,对(1R,2R)-2-氨基环己醇最大反应速率仅为0.149 U/mg,且通过MVTA无法对外消旋反式-2-氨基环己醇进行拆分;另外发现该酶对2-羟基环己酮几乎没有活力。其次,通过两轮随机突变对MVTA进行改造,采用TTC-M9高通量平板筛选方法,筛选得到4个有益突变体,基因序列测序后对这些位点均进行单点饱和突变和组合突变,比较各突变体的突变效果,最终得到突变体MVTA＿L202K的活力和选择性最高。对MVTA＿L202K酶学性质进行了表征,包括动力学参数、温度及酸碱耐受性等。当底物为(1S,2S)-2-氨基环己醇和(1R,2R)-2-氨基环己醇时,突变体MVTA＿L202K的K值分别为19.100 m M和4.114m M,V值分别为0.133 U/mg和1.362 U/mg蛋白,且催化效率比野生酶提高了近50倍;对(1R,2S)-2-氨基环己醇和(1S,2R)-2-氨基环己醇的K值分别为13.647 m M和4.417 m M,V值分别为0.610 U/mg和1.628 U/mg蛋白;对(1S,2S)-2-氨基环戊醇和(1R,2R)-2-氨基环戊醇活力的K值分别为15.003 m M和3.359 m M,V值分别为0.985 U/mg和1.277 U/mg蛋白;对(1S,2S)-茚氨醇和(1R,2R)-茚氨醇的K值分别为10.961 m M和4.704 m M,V值分别为0.985 U/mg和2.153 U/mg蛋白;对(1R,2S)-茚氨醇和(1S,2R)-茚氨醇的K值分别为6.173 m M和6.225 m M,V值分别为0.244U/mg和1.454 U/mg蛋白。通过MVTA＿L202K对外消旋反式-2-氨基环己醇成功进行动力学拆分,结果显示,底物转化率高达51.49%,底物e.e.值大于99%;通过MVTA＿L202K对(R)-2-羟基环己酮(10-50 m M)进行了不对称还原胺化反应,产物(1R,2R)-2-氨基环己醇转化率为27-100%,e.e.值大于99%。由于目前尚无MVTA的蛋白晶体结构,通过Swiss Model同源建模得到MVTA的三维结构,采用MOE和Discovery Studio软件以2-氨基环己醇为底物进行分子对接,力场优化后分析突变结果。结果显示突变后的MVTA-L202K不仅拉近了与PLP的空间距离,同时增加了内部氢键数目与离子相互作用。最后,通过组合环氧化物水解酶(SpEH)、醇脱氢酶(BDHA)和转氨酶(MVTA-L202K)的三酶一锅煮级联催化体系首次对环己烯氧化物进行了不对称开环合成手性2-氨基环己醇。并构建三酶共表达细胞E.coli(SpEH-BDHA-MVTA＿L202K),通过E.coli(SpEH-BDHA-MVTA＿L202K)整体细胞对环己烯氧化物进行了不对称开环反应,产物(1R,2R)-2-氨基环己醇转化率高达93%,e.e.值大于99%。

关键词： ω-转氨酶定向进化手性环氨基醇级联催化不对称开环

固定化海洋脱氮假弧菌转氨酶实现可循环生物催化

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江苏海洋大学学报（自然科学版） 2023年第4期32卷 22-28页

作者：邵小芙果波高嵩曹阳江苏海洋大学药学院江苏连云港222005 江苏海洋大学江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室江苏连云港222005

海洋脱氮假弧菌ω-转氨酶区别于以往报道的ω-转氨酶,可实现对催化中心的远端手性位点的立体选择性识别,这种独特的(S)-型转氨基催化活性使其可在1-四氢萘胺和1-氨基茚满的脱氨基反应中发挥高效效用。但酶材料的生产及使用成本限制了其... 详细信息

海洋脱氮假弧菌ω-转氨酶区别于以往报道的ω-转氨酶,可实现对催化中心的远端手性位点的立体选择性识别,这种独特的(S)-型转氨基催化活性使其可在1-四氢萘胺和1-氨基茚满的脱氨基反应中发挥高效效用。但酶材料的生产及使用成本限制了其应用。以可高效保留酶的精细化功能的T4噬菌体衣壳为固定化材料,通过将海洋脱氮假弧菌ω-转氨酶与T4噬菌体衣壳附加蛋白Soc构建融合,成功实现了海洋脱氮假弧菌ω-转氨酶位于T4噬菌体衣壳Soc结合位点的结合固定。固定化酶保留了较好的催化活性,且每轮回收的酶活平均保留率>92%。该方法基于Soc蛋白及T4噬菌体衣壳间的高生物亲和性以生物材料建立了海洋脱氮假弧菌ω-转氨酶的酶活精细化固定化方式,实现了对酶催化活性的高效回收,有望推动海洋脱氮假弧菌ω-转氨酶的应用发展。

关键词： ω-转氨酶 T4噬菌体衣壳固定化酶生物催化立体选择性