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黄秋葵ζ-胡萝卜素脱氢酶基因(HeZDS)的克隆与表达分析

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农业生物技术学报 2020年第5期28卷 836-846页

作者：李永平王彬陈敏氡朱海生温庆放福建省蔬菜遗传育种重点实验室/福建省农业科学院作物研究所/福建省农业科学院蔬菜研究中心

胡萝卜素脱氢酶(ζ-carotene desaturase, ZDS)是类胡萝卜素合成的重要限速酶,其催化ζ-胡萝卜素生成番茄红素。本研究根据黄秋葵(Hibiscus esculentus)转录组测序获得的序列数据,设计引物克隆得到1条2 189 bp的ZDS基因cDNA全长,其具有1... 详细信息

胡萝卜素脱氢酶(ζ-carotene desaturase, ZDS)是类胡萝卜素合成的重要限速酶,其催化ζ-胡萝卜素生成番茄红素。本研究根据黄秋葵(Hibiscus esculentus)转录组测序获得的序列数据,设计引物克隆得到1条2 189 bp的ZDS基因cDNA全长,其具有1 686 bp的ORF;编码561个氨基酸,理论分子量为61.79kD,等电点(pI)为6.807;编码的蛋白与亚洲棉(Gossypium arboreum)、陆地棉(G. hirsutum)、黄麻(Corchorus capsularis)、榴莲(Durio zibethinus)、可可(Theobroma cacao)等蛋白的同源性均超过90%,显示其高度的保守性,将基因命名为HeZDS,GenBank登录号为:MG372371。qRT-PCR定量分析表明,黄秋葵根、茎、叶、花和果实等器官中都有检测到HeZDS基因;叶发育过程中以成熟叶中表达量最高,果实发育中以花后2 d高表达。HeZDS基因的表达与类胡萝卜素含量存在密切的相关性。本研究为HeZDS的功能和类胡萝卜素调控机制研究提供了资料基础。

关键词：黄秋葵 ζ-胡萝卜素脱氢酶类胡萝卜素基因克隆

观赏向日葵ζ-胡萝卜素脱氢酶基因HaZDS的克隆与表达分析

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植物遗传资源学报 2015年第4期16卷 828-835页

作者：钟淮钦吴建设黄敏玲樊荣辉罗远华林兵叶秀仙福建省农业科学院作物研究所/福建省农业科学院花卉研究中心/福建省特色花卉工程技术研究中心福州350013

采用RT-PCR和RACE技术,从观赏向日葵新品种闽葵3号黄色花瓣中克隆获得类胡萝卜素合成途径关键酶基因ZDS,命名为Ha ZDS(Gen Bank ***263657),该基因c DNA全长2069 bp,具有一个1761 bp的完整开放阅读框(ORF),编码587个氨基酸。推导氨基酸... 详细信息

采用RT-PCR和RACE技术,从观赏向日葵新品种闽葵3号黄色花瓣中克隆获得类胡萝卜素合成途径关键酶基因ZDS,命名为Ha ZDS(Gen Bank ***263657),该基因c DNA全长2069 bp,具有一个1761 bp的完整开放阅读框(ORF),编码587个氨基酸。推导氨基酸序列分析表明,Ha ZDS蛋白在N-末端区域含有一个叶绿体转运肽序列,含有一个典型的氨基氧化酶结构域和NAD(P)结合结构域,存在一个特征序列。系统发育分析表明,观赏向日葵Ha ZDS与万寿菊、菊花蛋白的同源性分别达96.4%、90.1%,亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR技术分析结果显示,Ha ZDS基因在盛花期表达量最高,不同组织中的表达量舌状花瓣>绿色管状花>苞片>叶片>黑色管状花,随着花瓣黄色的加深,基因表达量逐渐增加。推测Ha ZDS基因在转录水平上参与观赏向日葵花色形成的调控。

关键词：观赏向日葵 ζ-胡萝卜素脱氢酶基因克隆基因表达

草莓ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS的克隆及特征分析

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热带亚热带植物学报 2010年第6期18卷 670-674页

作者：李永平朱海生温庆放花秀凤林珲福建省农业科学院作物研究所蔬菜研究中心福州350013 福州市蔬菜科学研究所福州350012

用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria ananassa Duchesne)果实中克隆到ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS,命名为FaZDS,其cDNA全长2148 bp,具有1个1710 bp的完整开放阅读框(ORF),编码569个氨基酸。序列分析表明,FaZDS编码的氨基酸序列与其它植物... 详细信息

用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria ananassa Duchesne)果实中克隆到ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS,命名为FaZDS,其cDNA全长2148 bp,具有1个1710 bp的完整开放阅读框(ORF),编码569个氨基酸。序列分析表明,FaZDS编码的氨基酸序列与其它植物的ZDS蛋白有很高的相似性。系统进化树分析表明,草莓与苹果的ZDS蛋白亲缘关系较近。原核表达结果表明FaZDS基因在大肠杆菌中能高效表达。用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析表明,FaZDS基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达,表达量为花>红果>粉红果>白果>青果>叶。

关键词：草莓 ζ-胡萝卜素脱氢酶 FaZDS基因基因克隆

巴氏杜氏藻ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与分析

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现代食品科技 2012年第7期28卷 764-767页

作者：肖岚劳永民姜建国华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006

ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因是胡萝卜素生物合成途径中的一个关键酶之一。根据实验室已获得的巴氏杜氏藻ZDS基因的cDNA序列,设计引物,通过分段PCR的方法,获得ZDS基因的编码区序列。然后根据获得编码区序列,利用染色体步移的方法获得其... 详细信息

ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因是胡萝卜素生物合成途径中的一个关键酶之一。根据实验室已获得的巴氏杜氏藻ZDS基因的cDNA序列,设计引物,通过分段PCR的方法,获得ZDS基因的编码区序列。然后根据获得编码区序列,利用染色体步移的方法获得其两端侧翼序列:启动子和终止子,并利用生物信息学工具对获得序列进行分析。实验获得的完整ZDS基因全长11896 bp,其中编码区序列(从"ATG"到"TAA")长度为6435,编码区上游序列4091 bp(包括33 bp的5’UTR序列),编码区下游序列1370 bp(包括411 bp的3’UTR序列)。将编码序列与cDNA(开放阅读框)进行比对,发现整个编码区序列含有12个外显子和11个内含子,其中内含子长度达4686 bp,约为外显子长度的2.68倍,内含子均以GT开始,AG收尾,属于最常见的内含子类型。通过生物信息学分,发现ZDS启动子中具有多种转录因子结合位点,包括与光调控有关的GAGAbox,ASF1;与植物黄化反应有光的ACGTbox等。

关键词：巴氏藻 ζ-胡萝卜素脱氢酶编码区启动子生物信息学

烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与生物信息学分析

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烟草科技 2012年第3期45卷 34-37,63页

作者：胡重怡雷波刘冬蔡刘体贵州省烟草科学研究所贵阳市金阳新区云潭北路550081 长江大学农学院湖北省荆州市荆秘路88号434023

利用同源克隆和电子克隆方法,从烤烟栽培品种韭菜坪2号(Nicotiana tobacum ***2)中克隆获得烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶(zeta-carotene desaturase,ZDS)基因的全长cDNA序列(命名为T-zds1),并对其编码蛋白的一级、二级进行了预测。该基因在Gen... 详细信息

利用同源克隆和电子克隆方法,从烤烟栽培品种韭菜坪2号(Nicotiana tobacum ***2)中克隆获得烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶(zeta-carotene desaturase,ZDS)基因的全长cDNA序列(命名为T-zds1),并对其编码蛋白的一级、二级进行了预测。该基因在GenBank中的登录号为JF975566,全长为2312 bp,编码的蛋白含588个氨基酸,蛋白登录号AEG73891。BLASTp搜索结果及进化分析结果表明,烤烟T-zds1基因编码氨基酸序列与番茄、向日葵、胡萝卜ZDS基因编码氨基酸序列的相似性分别为97%,92%,90%。

关键词：烤烟基因克隆 ζ-胡萝卜素脱氢酶

原壳小球藻八氢番茄红素脱氢酶和ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆和分析

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原壳小球藻八氢番茄红素脱氢酶和ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆和...

作者：淦志兵上海交通大学

学位级别：硕士

类胡萝卜素（carotenoids）是类异戊二烯化合物及其通过氧化氢化脱氢环化酮基化，以及碳架的重排降解等作用的衍生物，广泛存在于花卉水果蔬菜藻类细菌真菌中，分为不含氧原子的胡萝卜素（carotenes）族和含氧官能团（如羟基环氧基甲氧... 详细信息

类胡萝卜素（carotenoids）是类异戊二烯化合物及其通过氧化氢化脱氢环化酮基化，以及碳架的重排降解等作用的衍生物，广泛存在于花卉水果蔬菜藻类细菌真菌中，分为不含氧原子的胡萝卜素（carotenes）族和含氧官能团（如羟基环氧基甲氧基等）的衍生物及其酯类的叶黄素（xanthophylls）族由于富含叶黄素等类胡萝卜素，小球藻（Chlorella）作为一种极具潜力的叶黄素源而备受关注目前关于小球藻类胡萝卜素的研究中，主要采用培养条件的优化和提取工艺的改进来提高叶黄素产量，少见采用代谢途径改造等基因工程的办法来实现这一目标本论文将类胡萝卜素代谢过程中关键限速酶八氢番茄红素脱氢酶（phetoene desaturase，PDS）和ζ-胡萝卜素脱氢酶（ζ-carotene desaturase，ZDS）的基因作为研究对象，通过对原壳小球藻（Chlorella protothecoides CS-41）PDS ZDS基因的克隆和特征分析，为进一步揭示类胡萝卜素合成的分子代谢机制奠定基础，此外，还对原壳小球藻的遗传转化条件进行了初步的探索主要研究内容及结果如下： 1通过cDNA末端快速扩增（RACE）和RT-PCR对C. protothecoidesCS-41核基因组上的PDS ZDS基因进行扩增，得到2054bp PDS基因的cDNA序列（GenBank登录号：FJ968162），及大小分别为3857bp（GenBank登录号：GU269620）和1802bp（GenBank登录号：GU269621）的两条PDS基因的DNA序列;以及得到了2031bp ZDS基因的cDNA序列（GenBank登录号：GU269622）及其4713bp的DNA序列（GenBank登录号：GU269623） 2通过PDS ZDS基因对应的氨基酸序列的生物信息学分析，发现它与高等植物和其它藻类的相应基因具有很高的相似性，在PDS ZDS基因对应的氨基酸序列中都发现了三个类似的功能区域：典型的双核苷酸结合位点底物运输结合位点和类胡萝卜素的结合位点，并在N端都发现了转运肽的存在同时，进化树分析结果表明，藻类群中小球藻和衣藻的亲缘关系比较近 3成功构建了原核表达载体pET-PDS，通过IPTG诱导，使PDS基因在宿主菌BL21(DE3)中成功地高效表达，并通过Western blot免疫印迹法分析，进一步表明所表达的融合蛋白就是PDS通过颜色互补反应，证实了PDS蛋白能够催化两步脱氢反应，将无色的八氢番茄红素转化成浅黄色的ζ-胡萝卜素，同时也证明了原壳小球藻的PDS蛋白属于植物型的八氢番茄红素脱氢酶 4通过研究原壳小球藻对六种常用抗生素的敏感性，确定了原壳小球藻遗传转化可以采用的筛选抗生素种类及其工作浓度，发现原壳小球藻对G418最敏感，工作浓度为10μg/ml，为后续的原壳小球藻基因工程研究奠定了基础 5以载体pHB为基础，成功构建了植物表达载体pHB-PDS，初步尝试通过农杆菌介导法将植物表达载体pHB-PDS转入模式生物拟南芥中，成功获得了抗性植株，其功能验证正在进行中

关键词：原壳小球藻类胡萝卜素八氢番茄红素脱氢酶 ζ-胡萝卜素脱氢酶抗生素原核表达真核表达

巴氏杜氏藻ζ-胡萝卜素脱氢酶基因启动子序列的克隆及其活性验证

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巴氏杜氏藻ζ-胡萝卜素脱氢酶基因启动子序列的克隆及其活性验证

作者：肖岚华南理工大学

学位级别：硕士

杜氏藻是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻，其抗逆性极强,能够在在0.05mol/Lmol/L的盐水中生长，是今所发现的最耐盐的真核生物，并被作为研究植物和藻类耐盐机理的重要模式生物。巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)作为杜氏藻的一个常见藻... 详细信息

杜氏藻是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻，其抗逆性极强,能够在在0.05mol/Lmol/L的盐水中生长，是今所发现的最耐盐的真核生物，并被作为研究植物和藻类耐盐机理的重要模式生物。巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)作为杜氏藻的一个常见藻种，其能够在极端条件，如高盐，高光照强度，高温等条件下大量累积β-胡萝卜素，其主要以两种形式存在，即9-顺式和全反式两种异构体，用以保护细胞免受光抑制作用的伤害。在不同的诱导条件下，巴氏藻细胞内的β-胡萝卜素含量可达到细胞干重的14%。从遗传学角度分析，巴氏藻对β-胡萝卜素的富集主要是受到类胡萝卜素代谢途径中各种酶的调节。酶的代谢又受到基因的调控，这些酶基因的启动子中存在着各种作用元件，这些作用元件受到不同环境因素的影响，从而调节目的基因的合成量，进而影响最终整个代谢调控。 ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因是胡萝卜素生物合成途径中的一个关键酶之一。本实验中，根据实验室已获得的D. bardawil藻ZDS基因的cDNA序列，设计引物，通过PCR的方法，获得ZDS基因的编码区序列。然后根据获得编码区序列，利用基因组步移的方法获得其两端侧翼序列：启动子和终止子。实验室已经得到ZDS基因的cDNA序列全长2209bp，其中开放阅读框长度为1749bp。本实验获得的完整ZDS基因全长11,896bp，其中编码区序列(从”ATG”到”TAA”)长度为6435，编码区上游序列4091bp(包括33bp的5’UTR序列)，编码区下游序列1370bp (包括411bp的3’UTR序列)。将编码序列与cDNA的开放阅读框进行比对，发现整个编码区序列含有12个外显子和11个内含子，其中内含子长度达4686bp，约为外显子(ORF)长度的2.68倍，内含子均以GT开始，AG收尾，属于最常见的内含子类型。根据生物信息学分析的转录起始位点信息，以ZDS基因编码区序列上游2899bp序列为启动子，下游1217bp序列为终止子，以增强型绿色荧光基因(EGFP)为报告基因，构建基因表达盒pZDS-EGFP-tZDS。利用电转化法，将含有表达盒的重组质粒导入巴氏杜氏藻中，并成功表达EGFP蛋白，从而验证了ZDS基因的启动子和终止子具有活性。

关键词：巴氏杜氏藻 ζ-胡萝卜素脱氢酶增强型绿色荧光蛋白启动子与终止子

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胡萝卜DcZDS基因的克隆和表达分析

北方园艺 2022年第22期 9-15页

作者：安文杰张亚楠常双峰武喆山西林业职业技术学院园艺系山西太原030001 山西农业大学园艺学院山西太谷030801

以黄色胡萝卜‘黄珊瑚’(19071)、橙色胡萝卜‘新黑田五寸’(C1)、红色胡萝卜‘玫瑰红’(17106)为试材,采用生物信息学方法,研究了3个品种胡萝卜克隆得到的DcZDS基因编码的氨基酸组成和理化性质及其肉质根在不同发育阶段DcZDS基因的相... 详细信息

以黄色胡萝卜‘黄珊瑚’(19071)、橙色胡萝卜‘新黑田五寸’(C1)、红色胡萝卜‘玫瑰红’(17106)为试材,采用生物信息学方法,研究了3个品种胡萝卜克隆得到的DcZDS基因编码的氨基酸组成和理化性质及其肉质根在不同发育阶段DcZDS基因的相对表达量,以期为DcZDS基因对番茄红素合成的影响提供参考依据。结果表明:3个品种胡萝卜DcZDS基因的cDNA全长均为1722 bp,编码573个氨基酸;DcZDS基因编码蛋白的理化性质基本相同,均属于亲水性且不稳定的蛋白;编码蛋白的二级结构主要包含α-螺旋和无规则卷曲,且主要在叶绿体中发挥作用,是一种非分泌性蛋白;系统进化树分析发现,胡萝卜DcZDS基因与芹菜DcZDS的亲缘关系最近。在肉质根发育的不同时期DcZDS基因的表达量均呈现先升高后降低的模式,但在肉质根发育的65 d时,DcZDS在红色肉质根中的表达量显著高于橙色和黄色肉质根,说明DcZDS的高表达促进了番茄红素在红色胡萝卜中的积累。

关键词：胡萝卜(Daucus carota L.) ζ-胡萝卜素脱氢酶基因克隆表达分析

万寿菊类胡萝卜素合成途径基因克隆与功能分析

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万寿菊类胡萝卜素合成途径基因克隆与功能分析

作者：张恩启合肥工业大学

学位级别：硕士

植物次生代谢产物中的萜类物质因其缩合程度和衍生修饰不同而呈现结构差异性及生物活性多样性,尤其在植物与环境相互作用中发挥功能。其中,四萜类胡萝卜素和含有二萜侧链的叶绿素,在光合作用、抗氧化等方面具有不可替代的重要作用,也是... 详细信息

植物次生代谢产物中的萜类物质因其缩合程度和衍生修饰不同而呈现结构差异性及生物活性多样性,尤其在植物与环境相互作用中发挥功能。其中,四萜类胡萝卜素和含有二萜侧链的叶绿素,在光合作用、抗氧化等方面具有不可替代的重要作用,也是植物的主要呈色物质。这些呈色物质在植物不同组织中的合成积累与含量差异,诱导授粉和传播动物的行为,也赋予植物园艺观赏性。万寿菊(Tagetes erecta L.)因其花色绚丽多变,作为观赏植物在世界范围内广泛种植,更由于富含类胡萝卜素,成为提取天然色素的重要植物资源。高色素含量提示万寿菊的类胡萝卜素合成途径遗传基因的高效性,因此本研究利用前期万寿菊转录组数据,从高色素品种克隆了类胡萝卜素生物合成相关基因(Te PSY、Te ZDS、Te CHY、Te CYP、Te CCS、Te CCD4、Te NCED2),以及叶绿素合成基因(Te PPO)。通过测序验证,获得了这8个基因的全长编码序列。进一步利用同源建模方法构建系统发育进化树,分析了它们在不同植物物种间的进化关系。结果显示,万寿菊类胡萝卜素合成途径基因与数据库已收录的向日葵同源基因相似性最高。此外,对编码蛋白理化性质和三维结构的分析预测,也为所克隆基因的功能分析提供了生物信息学线索。为进一步验证万寿菊类胡萝卜素催化酶基因的功能活性,构建了Te ZDS、Te CHY Te CYP、Te CCS和Te NCED2基因植物表达载体,并对合成途径上游催化番茄红素合成的ζ-胡萝卜素脱氢酶(ζ-carotene desaturase)基因Te ZDS进行果蔬模式植物番茄的遗传转化,获得表达Te ZDS的番茄株系。表型分析显示,转基因植株的株高、株型与叶型,及开花时间与野生型并无显著差异,但转入Te ZDS的番茄果实提前转色,成熟果实颜色更深。色素含量测定结果表明,Te ZDS转化株系果实中番茄红素、β-胡萝卜素的含量均显著高于野生型。提示万寿菊Te ZDS基因的引入可提高果实色素品质,但对番茄植株的生长发育没有明显不利影响。上述结果表明,万寿菊Te ZDS基因具有催化类胡萝卜素合成的功能活性,及用于果蔬作物色素遗传改良的应用潜力。此外,对Te PPO基因在不同花色万寿菊各发育阶段花组织中的定量表达分析结果提示,叶绿素合成途径基因Te PPO可能与万寿菊花色中的绿色呈色有关。综上所述,本研究通过克隆、分析万寿菊中与类胡萝卜素合成、花色形成有关的8个基因,并对其中Te ZDS基因进行番茄遗传转化和功能分析,为后续进一步深入探讨高色素植物的类胡萝卜素积累分子机制,改良果蔬作物色素营养品质提供了新的基因资源和研究基础。

关键词：次生代谢类胡萝卜素合成途径基因克隆遗传转化 ζ-胡萝卜素脱氢酶