巴氏杜氏藻ζ-胡萝卜素脱氢酶基因启动子序列的克隆及其活性验证

作     者：肖岚 

作者单位：华南理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：姜建国

授予年度：2012年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：巴氏杜氏藻 ζ-胡萝卜素脱氢酶 增强型绿色荧光蛋白 启动子与终止子 

摘      要：杜氏藻是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻，其抗逆性极强,能够在在0.05mol/Lmol/L的盐水中生长，是今所发现的最耐盐的真核生物，并被作为研究植物和藻类耐盐机理的重要模式生物。巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)作为杜氏藻的一个常见藻种，其能够在极端条件，如高盐，高光照强度，高温等条件下大量累积β-胡萝卜素，其主要以两种形式存在，即9-顺式和全反式两种异构体，用以保护细胞免受光抑制作用的伤害。在不同的诱导条件下，巴氏藻细胞内的β-胡萝卜素含量可达到细胞干重的14%。从遗传学角度分析，巴氏藻对β-胡萝卜素的富集主要是受到类胡萝卜素代谢途径中各种酶的调节。酶的代谢又受到基因的调控，这些酶基因的启动子中存在着各种作用元件，这些作用元件受到不同环境因素的影响，从而调节目的基因的合成量，进而影响最终整个代谢调控。 ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因是胡萝卜素生物合成途径中的一个关键酶之一。本实验中，根据实验室已获得的D. bardawil藻ZDS基因的cDNA序列，设计引物，通过PCR的方法，获得ZDS基因的编码区序列。然后根据获得编码区序列，利用基因组步移的方法获得其两端侧翼序列：启动子和终止子。实验室已经得到ZDS基因的cDNA序列全长2209bp，其中开放阅读框长度为1749bp。本实验获得的完整ZDS基因全长11,896bp，其中编码区序列(从ATG到TAA)长度为6435，编码区上游序列4091bp(包括33bp的5’UTR序列)，编码区下游序列1370bp (包括411bp的3’UTR序列)。将编码序列与cDNA的开放阅读框进行比对，发现整个编码区序列含有12个外显子和11个内含子，其中内含子长度达4686bp，约为外显子(ORF)长度的2.68倍，内含子均以GT开始，AG收尾，属于最常见的内含子类型。 根据生物信息学分析的转录起始位点信息，以ZDS基因编码区序列上游2899bp序列为启动子，下游1217bp序列为终止子，以增强型绿色荧光基因(EGFP)为报告基因，构建基因表达盒pZDS-EGFP-tZDS。利用电转化法，将含有表达盒的重组质粒导入巴氏杜氏藻中，并成功表达EGFP蛋白，从而验证了ZDS基因的启动子和终止子具有活性。