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Antitumor Effect of Cationic INKKI Peptide from Bovine <i>β</i>-casein on Melanoma B16F10

Journal of Cancer Therapy 2012年第4期3卷 237-244页

作者： Ricardo Alexandre Azevedo Adilson Kleber Ferreira Aline Vivian Vatti Auada Kerly Fernanda Mesquita Pasqualoto Rafael Marques-Porto Durvanei Augusto Maria Ivo Lebrun Butantan Institute Biochemistry and Biophysical Laboratory Sao Paulo Brazil

Cationic peptide with the sequence INKKI 41-45 was isolated from bovine β-casein after tryptic hydrolysis and synthetized. The aim of this work was to evaluate the antiproliferative activity in vitro and antitumor effect in animal model. The in vitro cytotoxicity was evaluated on B16F10 melanoma cells by MTT assay. Detection of apoptosis was measured using the annexin V/PI double staining and cell cycle analysis performed flow cytometry. Caspase-3 activity was analyzed with substrate specific fluorogenic DEVD-MCA. In vivo, antitumor activity was evaluated in B16F10 melanoma tumor-bearing C57BL/6J mice. The animals were treated with 55 mg/kg INKKI administered into peritumoral region, while control group received saline solution. The following antitumor parameters were examined: tumor volume, number of metastases, tumor delayed time, tumor doubling time. Histological analyses were performed with H & E staining. The results showed that INKKI induced dose-response cytotoxicity selective for B16F10 melanoma cells (IC50 1.7 μM) and did not present cytotoxic effects for FN1 fibroblast cells. INKKI-induced apoptosis detected trough of annexin V/PI assay and it was accompanied with an increase of sub-G1 apoptotic fractions and significant increase of caspase-3 cleavage. The tumor-bearing mice treated with INKKI showed a significant reduction in tumor volume of 72.62% and decreased of metastasis number loci. In addition, INKKI caused a significant delay in tumor growth and prolonged the tumor doubling time. Histological analysis revealed an increased of necrosis areas and reduction of tumor cells in tumor treated with INKKI, it was a many hallmark of its antitumor effects observed from in vivo experiments. In conclusion, we show that INKKI is a peptide that could be considered a new putative candidate development to anticancer therapy drug.

关键词： β-casein Peptide Apoptosis Metastasis Tumor Growth Melanoma

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Bovine <i>β</i>-casein: Detection of two single nucleotide polymorphisms by bidirectional allele specific polymerase chain reaction (BAS-PCR) and monitoring of their variation

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Open Journal of Animal Sciences 2013年第1期3卷 36-41页

作者： Stefania Chessa Omar Bulgari Attilio Rossoni Gabriella Ceriotti Anna Maria Caroli Department of Molecular and Translational Medicine University of Brescia Brescia Italy Department of Veterinary Science and Technology for Food Safety University of Milan Milano Italy IBBA-CNR Milano Italy Italian Brown Breeders Association Bussolengo Italy

Due to the functional importance of bovine milk protein polymorphisms, their correct discrimination is of great interest both from a scientific and practical point of view. Nowadays a large number of commercial platforms are available for semiautomated or fully automated SNP geno-typing. However, in some cases the use of simple and rather cheap methods is an effective tool to be implemented within one’s own laboratory for the routine analysis of a specific SNP. The present paper describes two simple tests based on the bidirectional allele-specific polymerase chain reaction (BAS-PCR) developed for the identification of β-casein (CSN2) B and I genetic variants. The practical application of the two methods on a panel of 84 Italian Brown bulls and 100 Italian Friesian cows is also discussed, including the biological significance of the two genetic variants and the importance of taking their occurrence into account when linkage analyses are performed on milk functional properties. A combined system for analysing milk protein variants by isoelectrofocusing (IEF) and the BAS-PCR assay developed for CSN2*I is described.

关键词： Bovine β-casein Milk Protein Polymorphism

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LPS对小鼠乳腺组织中NF-κB、ACCα和β-casein mRNA表达的影响

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中国兽医学报 2014年第2期34卷 253-258页

作者：侯瑛倩陶慧常广军林晶晶沈向真南京农业大学动物医学院江苏南京210095

为探讨灌注不同质量浓度LPS对小鼠乳腺组织中NF-κB、ACCα和β-casein mRNA表达的影响,选择30只雌性ICR小鼠为试验动物,受孕后随机分为试验组和对照组,试验组经第4对乳头灌注不同质量浓度LPS(0.1,5,10,50,100mg/L),对照组灌注生理盐水... 详细信息

为探讨灌注不同质量浓度LPS对小鼠乳腺组织中NF-κB、ACCα和β-casein mRNA表达的影响,选择30只雌性ICR小鼠为试验动物,受孕后随机分为试验组和对照组,试验组经第4对乳头灌注不同质量浓度LPS(0.1,5,10,50,100mg/L),对照组灌注生理盐水,于灌注后6h采集乳腺组织样品,组织学方法分析乳腺组织的病理变化;采用RT-PCR方法分析乳腺组织中NF-κB、ACCα和β-casein mRNA表达的变化。病理切片结果显示,随着LPS灌注浓度的增加,乳腺小叶间炎性细胞数量逐步增加,乳腺小叶内腺泡结构破坏程度也变大;对乳腺组织中NF-κB、ACCα和β-casein的mRNA表达水平进行分析时,发现灌注LPS小鼠乳腺组织中NF-κB mRNA的表达水平随着LPS灌注浓度的增加而逐步增加,而ACCα和β-casein mRNA的表达水平则随着LPS灌注浓度的增加而逐步降低。结果表明,灌注LPS能够上调NF-κB mRNA的表达,下调ACCα和β-casein mRNA的表达。

关键词： LPS 小鼠乳房炎 NF-kB ACCa β-casein

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Unfolding and Refolding Details of Lysozyme in the Presence of β-casein Micelles

Unfolding and Refolding Details of Lysozyme in the Presence ...

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第一届全国生物物理化学会议暨生物物理化学发展战略研讨会

作者：吴富根罗俊杰尉志武 Department of Chemistry Tsinghua University

＜正＞We are interested in understanding the role electrostatics play in the self-assembly of protein complexes. Specifically,under what conditions and at which strength do the electrostatics affect the protein-protein interactions? To this end,we selected a small globular protein,lysozyme,to study how it unfolds and refolds in the presence of micelles composed of the unstructuredβ-casein proteins by using

关键词： lysozyme β-casein electrostatics unfolding/refolding protein-protein interaction

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High expression of human serum albumin in milk of trans-genie mice directed by the goat β-casein gene promoter region

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Chinese Science Bulletin 2001年第7期46卷 582-586页

作者： HUANG Ying, HUANG Ying, HUANG Zan,YAN Jingbin, MA Zhanlu, SHENG Min,REN Zhaorui, ZENG Yitao & HUANG ShuzhenShanghai Institute of Medical Genetics, Shanghai Children’s Hospital, Shanghai 200040, China

We have constructed a mammary gland expression vector that contained the goat β-casein gene pro-moter, 5’upstream regulatory region, exons 1, 2, intron 1 as well as the human serum albumin (hALB) mini-gene (including the full-long sequences of hALB cDNA and its intron 1). Injection of the vector into mouse tail veins showed that the recombinant construct was expressed only in mammary glands. The vector was microinjected into the mouse fertilized eggs, followed by transferring the eggs into the foster mice. 33 F0 mice were obtained. Of the 33, 8 mice (5 , 3 ) were transgenic with hALB gene integration identified by PCR as well as Southern blot hybridization. The integration rate was 24.2% (8/33). Western blot analysis showed that 3 female transgenic mice had hALB expression in their milk. The hALB contents in milk reached 3.54, 0.21 and 3.03 g/L, respectively.

关键词： human serum albumin goat β-casein transgenic mice mammary gland.

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LPS对小鼠乳腺组织中NF-κB、ACCα和β-casein mRNA表达的影响

LPS对小鼠乳腺组织中NF-κB、ACCα和β-Casein mRNA表达的影响

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中国畜牧兽医学会兽医外科学分会第20次学术研讨会暨第5次奶牛疾病学术会议

作者：侯瑛倩陶慧常广军林晶晶沈向真南京农业大学动物医学院

为探讨灌注不同浓度LPS对小鼠乳腺组织中NF-κB、ACCα和β-casein mRNA表达的影响,以30只雌性ICR小鼠为试验动物,受孕后随机分为试验组和对照组,试验组经第四对乳头灌注不同浓度LPS(0.1、5、10、50、100μg/mL),对照组灌注生理盐水,于... 详细信息

为探讨灌注不同浓度LPS对小鼠乳腺组织中NF-κB、ACCα和β-casein mRNA表达的影响,以30只雌性ICR小鼠为试验动物,受孕后随机分为试验组和对照组,试验组经第四对乳头灌注不同浓度LPS(0.1、5、10、50、100μg/mL),对照组灌注生理盐水,于灌注后6 h采集样本,组织学分析乳腺病理变化;对乳腺组织中NF-κB、ACCa和β-casein mRNA表达变化进行分析。结果显示,灌注3 h、6 h乳腺腺泡内有大量的炎性细胞浸润,24 h腺泡结构崩解:对乳腺组织中NF-κB、ACCa和p-casein的mRNA表达水平进行分析时,发现灌注LPS小鼠乳腺组织中NF-κBmRNA的表达极显著高于对照组(Pβ-casein mRNA的表达极显著低于对照组(Pβ-casein mRNA的表达。

关键词： LPS 小鼠乳房炎 NF-κB ACCa β-casein

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LPS对小鼠乳腺组织中功能基因表达的影响及机理研究

LPS对小鼠乳腺组织中功能基因表达的影响及机理研究

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作者：侯瑛倩南京农业大学

学位级别：硕士

奶牛亚急性瘤胃酸中毒是奶牛特别是高产奶牛的常见疾病,也是造成当今世界奶牛业巨大损失的疾病之一。随着病情的发展慢性瘤胃酸中毒产生的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)会随着血液循环到达乳腺组织或其它器官引发乳腺炎等疾病。NF-κ... 详细信息

奶牛亚急性瘤胃酸中毒是奶牛特别是高产奶牛的常见疾病,也是造成当今世界奶牛业巨大损失的疾病之一。随着病情的发展慢性瘤胃酸中毒产生的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)会随着血液循环到达乳腺组织或其它器官引发乳腺炎等疾病。NF-κB信号转导通路是LPS所介导的信号转导通路中最重要的下游通路,在天然免疫反应中起着极为重要的作用,现已经成为国内外学者的研究热点。激活的转录因子NF-KB,能够增强炎性细胞因子表达。本研究旨在以小鼠为实验模型,通过体外及体内实验,研究LPS对小鼠乳腺组织中NF-κB、ACCα和β-casein mRNA表达的影响,为相关的研究提供依据。1血液中LPS对小鼠肝脏和乳腺中功能基因表达的影响选取40只雌性ICR小鼠,受孕后随机分为试验组和对照组。在雌鼠生产第10～11天,试验组经尾静脉注射10μg/mL LPS0.2mL;对照组灌注0.2mL生理盐水,分别于灌注后3h、6h、12h、24h采集样本。眼静脉采血用于白细胞总数和白细胞分类计数的分析,部分肝脏和乳腺组织做石蜡切片,HE染色进行组织学观察;部分肝脏和乳腺组织提取总RNA,采用RT-PCR法,检测各组乳腺组织中NF-κB. ACCa和β-casein mRNA表达。组织学结果表明肝脏在注射后肝中央静脉扩张,肝窦充血,6h和24h有大量炎性细胞浸润,乳腺在注射后3h有炎性细胞浸润,6h腺泡腔内有大量炎性细胞浸润,24h腺泡结构崩解;血液中白细胞总数增加,中性粒细胞在各类白细胞中所占的百分比升高;各组中NF-κB、ACCa和和β-casein mRNA表达水平与对照组比较的分析结果表明,注射LPS能够增强肝脏中NF-κB mRNA表达,降低乳腺的ACCα和β-casein mRNA表达。肝脏中NF-κB mRNA表达在3h时显著升高而后呈下降的趋势,这种现象提示了这可能是一个急性的炎症反应。2LPS对小鼠乳腺组织中NF-κB、ACCa和β-casein mRNA表达的影响选取30只雌性ICR小鼠,受孕后随机分为试验组和对照组。在雌鼠生产第10-11天,试验组经第四对乳头分别灌注0.1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL LPS0.1mL;对照组灌注0.1mL生理盐水,于灌注后6h采集样本,部分乳腺组织做石蜡切片,HE染色进行组织学观察;部分乳腺提取总IRNA,采用RT-PCR法,检测各组乳腺组织中NF-κB、ACCa和β-casein mRNA表达。组织学结果表明随着灌注浓度的增大炎性细胞数量逐渐增多;各组NF-κB、ACCa和和β-casein mRNA表达水平进行分析表明灌注LPS能够显著增强NF-κB mRNA表达,降低ACCa和β-casein mRNA表达,试验组NF-κB mRNA表达除0.lμg/mL组与对照组相比差异不显著外其余各组NF-κB mRNA表达极显著高于对照组(Pβ-casein mRNA表达极显著低于对照组(Pβ-casein mRNA表达的影响取妊娠14～19天的ICR小鼠第四对乳腺,用胶原酶消化法进行原代乳腺上皮细胞培养。观察细胞形态,用MTT法绘制生长曲线确定细胞的对数生长期。培养原代乳腺上皮细胞,当处于对数生长期的细胞融合至80%～90%时,吸去培养基,用PBS洗两次,将细胞分为五个试验组和一个对照组,每组三个重复孔,试验组加入2mL LPS (0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、μg/mL.5μg/mL);对照组加入2mL DMEM培养液,放入培养箱,于6h后收集细胞提取RNA,采用RT-PCR法检测各组的NF-κB、 ACCa和和β-casein mRNA表达水平,试验重复三次。PCR扩增结果表明LPS刺激后能显著增强NF-κB mRNA表达,降低ACCa和β-casein mRNA表达,试验组中0.05μg/mL组、1μg/mL组、5μg/mL组NF-κB mRNA表达极显著高于对照组(Pcasein mRNA表达极显著低于对照组(P<0.01),但ACCa mRNA的表达仍有一个先升高后降低的过程。

关键词： LPS 小鼠乳腺 NF-κB ACCα β-casein

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温热环境和硫化氢对猪乳腺催乳素受体表达的影响及其机制

温热环境和硫化氢对猪乳腺催乳素受体表达的影响及其机制

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作者：胡宝玉华南农业大学

学位级别：硕士

温热环境和硫化氢对母猪泌乳性能与健康具有重要影响。在乳腺组织中,催乳素(PRL)与靶细胞膜表面的催乳素受体(PRLR)结合,激活多个信号通路(JAK2/STAT、PI3K/Akt和MAPK等途径)从而调控下游基因的表达。PRLR在乳腺的表达关系到动物的泌乳... 详细信息

温热环境和硫化氢对母猪泌乳性能与健康具有重要影响。在乳腺组织中,催乳素(PRL)与靶细胞膜表面的催乳素受体(PRLR)结合,激活多个信号通路(JAK2/STAT、PI3K/Akt和MAPK等途径)从而调控下游基因的表达。PRLR在乳腺的表达关系到动物的泌乳以及乳品质。Mi RNA是小的内源性非编码RNA,在动物体内主要是通过靶向m RNA 3′UTR发挥作用,研究发现mi RNA可以参与泌乳调控。本研究首先检测夏季和冬季组的乳腺组织PRLR和β-casein的表达,对乳腺组织进行mi RNA测序,分析差异表达的mi RNAs并进行验证等。然后,采用小鼠乳腺上皮细胞(HC11细胞)为研究对象,对细胞进行高温和硫化氢处理后,检测PRLR等基因的表达和相关mi RNAs的表达。实验结果如下:1.夏季高温环境抑制乳腺PRLR m RNA和蛋白的表达;高温处理分化前和分化后HC11细胞1 h,均显著降低PRLR蛋白的表达。***11细胞诱导分化后,显著提高PRLR m RNA、β-caseinm RNA和蛋白的表达。3.100μM和600μM Na HS显著降低PRLR和β-casein的蛋白表达。100μM和600μM Na HS显著抑制HC11细胞PRLR、Akt m RNA的表达;600μM Na HS极显著抑制HC11细胞STAT5a m RNA的表达。*** RNA测序共检测到有196个差异表达的mi RNA(P≤0.05);Mi RNA保守性分析发现mi RNAs在牛、人、猪和鼠等不同物种上具有高度的保守性;差异mi RNAs靶基因主要富集在T细胞受体、肿瘤、吞噬体、N HTLV-1感染、NF-κB和B细胞受体等信号通路上。

关键词： PRLR H2S HC11细胞温热环境 β-casein 乳腺泌乳

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