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脂肪酸β-羟基化酶的区域选择性优化

脂肪酸β-羟基化酶的区域选择性优化

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作者：陈浩扬州大学

学位级别：硕士

在天然界中,羟基位于β-位的脂肪酸（Fatty acids,FAs）称为β-羟基脂肪酸（β-OH Fatty acid,β-OH FAs）,它们具有优秀的生物活性,是良好的化学合成前体,在许多领域应用都颇为广泛。但β-OH FAs尤其是手性β-OH FAs在化学合成上存在... 详细信息

在天然界中,羟基位于β-位的脂肪酸（Fatty acids,FAs）称为β-羟基脂肪酸（β-OH Fatty acid,β-OH FAs）,它们具有优秀的生物活性,是良好的化学合成前体,在许多领域应用都颇为广泛。但β-OH FAs尤其是手性β-OH FAs在化学合成上存在诸多限制:底物不易获取、底物不可再生、反应通常需要过渡金属和复杂的催化配体或昂贵的化学计量手性助剂的参与等。本课题研究对象P450BSβ是P450酶家族的一种羟基化酶,虽然能够一步氧化自然界中广泛存在的、绿色可再生的FAs,但反应由于较差的区域选择性生成1-烯烃、α-羟基脂肪酸（α-OH Fattyacid,α-OH FAs）和β-OHFAs三种产物。本研究通过对P450BSβ反应机理和蛋白结构的研究,对P450BSβ进行定向进化获得了一个工程化的酶突变体P450Bsβ-L78A/Q85A/V170I/G290I,实现以肉豆蔻酸（C14:0）为底物的区域选择性和立体异构选择性专一的催化脂肪酸β-位C-H羟基化反应,表现为β-羟基肉豆蔻酸产物:α-羟基肉豆蔻酸产物＞20:1以及β-羟基肉豆蔻酸产物的ee＞99%。该生物催化剂以廉价的过氧化氢作为氧化剂,在常温常压水相等温和的反应条件下,将易得、可再生的肉豆蔻酸专一的转化为手性的（R）-β-羟基肉豆蔻酸,而且具有良好的反应活性——转换数（Turnover number）和转换效率（Turnover frequency）分别达到1540和45.6 min-1。进一步的分子对接研究为该反应专一的区域选择性和立体异构选择性提供了理论基础:相较于野生型P450BSβ与底物的结合构像,在突变体P450BSβ-L78A/Q85A/V170I/G290I与底物的结合构像中,底物的Cα-亚甲基离酶活性中心更远而Cβ-亚甲基离酶活性中心更近,这解释了专一的区域选择性。此外,在突变体P450BSβ-L78A/Q85A/V170I/G290I与底物结合构象中,底物的Cβ-亚甲基的pro-R-H 比pro-S-H更接近酶活性中心,从而解释了 P450BSβ-L78A/Q85A/V170I/G290I突变体酶催化产物为专一的R构型产物。本课题的研究内容以实际应用为目标,在蛋白质工程,生物合成、结构生物学等多个领域进行探索,利用生物酶法代替传统的有机合成方法合成（R）-β-羟基化脂肪酸,推动绿色、环保的生物催化在合成β-OH FAs的应用。

关键词：蛋白质工程 P450酶 β-羟基化生物催化脂肪酸

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酶催化的羧酸β位未活化C-H键的对映选择性羟基化反应

酶催化的羧酸β位未活化C-H键的对映选择性羟基化反应

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作者：章昆扬州大学

学位级别：硕士

许多天然产物和药物都是手性含氧化合物,它们的合成通常依赖于已有官能团或氧化态的多步转化。而选择性C-H键氧化官能团化提供了一种不同的策略来获取这些分子,表现出高效的步骤、原子和氧化还原经济性。然而未活化的(sp3)C-H键氧化反... 详细信息

许多天然产物和药物都是手性含氧化合物,它们的合成通常依赖于已有官能团或氧化态的多步转化。而选择性C-H键氧化官能团化提供了一种不同的策略来获取这些分子,表现出高效的步骤、原子和氧化还原经济性。然而未活化的(sp3)C-H键氧化反应面临着:1)高键能带来的反应活性问题;2)分子中多个化学环境类似的C-H键所引起的化学、区域、立体选择性问题;3)多样化官能团与反应条件兼容性的问题。因此,C-H键的高度选择性氧化在化学上非常具有挑战性。化学策略通常依赖于分子内不同C-H键之间的反应差异或预先引入的导向基团来实现选择性,然而该策略不适用于链状脂肪酸。生物催化(酶)则采用了截然不同的策略:它们进化出底物结合通道,并将底物特定位点固定于反应中心,从而实现较好的区域和立体选择性控制。但是,未激活的脂肪族C-H键的对映选择性羟基化仍然没有太成功的结果。我课题组之前获得了专一催化脂肪族羧酸β位的区域和对映选择性的蛋白工程P450BSβ突变体酶(P450BSβ-L78A/Q85A/V170I/G290I),但是它所适底物极其局限于链长超过10个碳原子的脂肪酸(仅适用于7种底物),无法接受短链脂肪酸以及其它含有官能团的脂肪族羧酸化合物。为拓宽底物范围,我们选择催化效率低的辛酸为底物对P450BSβ酶进行定向进化,筛选到了高转化率和高β位选择性的P450BSβ-L78I/Q85H/G290I/突变体。该突变体将辛酸转化率从15%提高至90%,β位羟基化选择性由33%提高至86%。为探究该突变体酶的合成价值,我们对该酶进行了 0.5mmol制备级反应的底物研究,发现该酶摆脱了对烃链长度的依赖,能够催化C6-C20链长的脂肪酸,同时具有很好的官能团耐受性,展现了优越的反应活性以及高度的区域和对映选择性(Cβ/Cα大于20:1和大于99%的R-对映选择性)。为了进一步阐述该突变体蛋白的反应活性和选择性,我们解析了它与棕榈酸复合物的晶体结构。与野生型蛋白相比,三个氨基酸残基的改变使1)Cβ较Cα更加靠近活性中心;2)β位的pro(R)-H离Fe-O中心较pro(S)-H更近;3)突变体蛋白的反应腔小,更有利于催化短链的羧酸底物。因此该酶在实现高区域和对映选择性的同时,针对短链羧酸的反应活性得到了大大的提高。综上所述,我们对P450BSβ蛋白进行了定向进化改造,并成功应用于各种羧酸β位未活化C-H键的羟基化反应,取得了很好的反应活性、区域和对映选择性以及官能团耐受性。晶体结构分析从机理上阐明了氨基酸残基突变对反应活性和选择性的影响。该工作展现了生物催化在解决具有挑战性的化学反应问题中的潜能。

关键词： P450酶 β-羟基化定向进化脂肪族羧酸蛋白晶体结构

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