酶催化的羧酸β位未活化C-H键的对映选择性羟基化反应

作     者：章昆 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王喜庆

授予年度：2023年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：P450酶 β-羟基化 定向进化 脂肪族羧酸 蛋白晶体结构 

摘      要：许多天然产物和药物都是手性含氧化合物,它们的合成通常依赖于已有官能团或氧化态的多步转化。而选择性C-H键氧化官能团化提供了一种不同的策略来获取这些分子,表现出高效的步骤、原子和氧化还原经济性。然而未活化的(sp3)C-H键氧化反应面临着:1)高键能带来的反应活性问题;2)分子中多个化学环境类似的C-H键所引起的化学、区域、立体选择性问题;3)多样化官能团与反应条件兼容性的问题。因此,C-H键的高度选择性氧化在化学上非常具有挑战性。化学策略通常依赖于分子内不同C-H键之间的反应差异或预先引入的导向基团来实现选择性,然而该策略不适用于链状脂肪酸。生物催化(酶)则采用了截然不同的策略:它们进化出底物结合通道,并将底物特定位点固定于反应中心,从而实现较好的区域和立体选择性控制。但是,未激活的脂肪族C-H键的对映选择性羟基化仍然没有太成功的结果。我课题组之前获得了专一催化脂肪族羧酸β位的区域和对映选择性的蛋白工程P450BSβ突变体酶(P450BSβ-L78A/Q85A/V170I/G290I),但是它所适底物极其局限于链长超过10个碳原子的脂肪酸(仅适用于7种底物),无法接受短链脂肪酸以及其它含有官能团的脂肪族羧酸化合物。为拓宽底物范围,我们选择催化效率低的辛酸为底物对P450BSβ酶进行定向进化,筛选到了高转化率和高β位选择性的P450BSβ-L78I/Q85H/G290I/突变体。该突变体将辛酸转化率从15%提高至90%,β位羟基化选择性由33%提高至86%。为探究该突变体酶的合成价值,我们对该酶进行了 0.5mmol制备级反应的底物研究,发现该酶摆脱了对烃链长度的依赖,能够催化C6-C20链长的脂肪酸,同时具有很好的官能团耐受性,展现了优越的反应活性以及高度的区域和对映选择性(Cβ/Cα大于20:1和大于99%的R-对映选择性)。为了进一步阐述该突变体蛋白的反应活性和选择性,我们解析了它与棕榈酸复合物的晶体结构。与野生型蛋白相比,三个氨基酸残基的改变使1)Cβ较Cα更加靠近活性中心;2)β位的pro(R)-H离Fe-O中心较pro(S)-H更近;3)突变体蛋白的反应腔小,更有利于催化短链的羧酸底物。因此该酶在实现高区域和对映选择性的同时,针对短链羧酸的反应活性得到了大大的提高。综上所述,我们对P450BSβ蛋白进行了定向进化改造,并成功应用于各种羧酸β位未活化C-H键的羟基化反应,取得了很好的反应活性、区域和对映选择性以及官能团耐受性。晶体结构分析从机理上阐明了氨基酸残基突变对反应活性和选择性的影响。该工作展现了生物催化在解决具有挑战性的化学反应问题中的潜能。