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高效液相色谱法纯化蝎毒液中β—毒素

动物毒物学 1999年第1期14卷 46-48页

作者： Meria,BC 童德文

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产气荚膜梭菌β-毒素研究进展

宁夏农学院学报 1999年第3期20卷 74-78页

作者：王玉炯宁夏农学院银川750105

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产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体的制备及鉴定

产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体的制备及鉴定

作者：李翠松山东农业大学

学位级别：硕士

产气荚膜梭菌(***)又名魏氏梭菌是一种广泛分布于自然界和动物肠道中的细菌,属于条件性致病菌。可产生多种外毒素和酶类,其主要毒素是α、β、ε和ι,其中β毒素具有较强的神经毒性、细胞毒性和致死性。能够引起羊猝狙,犊牛、羔羊、仔... 详细信息

产气荚膜梭菌(***)又名魏氏梭菌是一种广泛分布于自然界和动物肠道中的细菌,属于条件性致病菌。可产生多种外毒素和酶类,其主要毒素是α、β、ε和ι,其中β毒素具有较强的神经毒性、细胞毒性和致死性。能够引起羊猝狙,犊牛、羔羊、仔猪肠毒血症,以及人和动物坏死性肠炎。在家畜感染造成快速的发病死亡,因此,称其为‘家畜猝死症’。在多种畜禽和野生动物发病,尤其3周内的幼小动物更易感染,给我国畜牧业造成了严重的损失。在80年代中期,我国曾经广泛而严重的爆发流行,后因抗生素的使用,使得该病的流行受到一定程度的抑制,有时临床症状不明显,但是仍有大量的报道。农业部将其列为二类传染病。本研究的主要目的是利用较纯的产气荚膜梭菌β毒素制备单克隆抗体。B、C型产气荚膜梭菌产生β毒素主要致死性毒素,但是C型菌也产生少量的α毒素。本研究首先采用了SephadexG-25对粗提的产气荚膜梭菌外毒素进行除盐,然后又通过SephadexG-200对浓缩液进行提纯的方法,最后得到了相对较纯的β毒素。我们将纯化的β毒素通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对分离的蛋白纯度进行检测。所以采用该方法纯化的蛋白对单克隆抗体的制备起了很重要的作用。本研究采用了天然纯化的β毒素对6-8周龄的BALB/c小鼠进行免疫,加强免疫3天后取免疫小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0进行细胞融合。经过间接ELISA筛选和有限稀释亚克隆法获得了2株稳定分泌针对C型产气荚膜梭菌β毒素的阳性的杂交瘤细胞株。将生长状态良好的阳性杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内,待小鼠腹部膨大后收集腹水。采用正辛酸-硫酸铵纯化方法进行纯化腹水,从而获得产气荚膜梭菌β毒素的单克隆抗体。本实验成功获得了两株抗β毒素的杂交瘤细胞,分别命名为1G7、2F4。对所得到的两株抗β毒素的杂交瘤细胞分泌的抗体经过间接ELISA方法可知,小鼠腹水中单抗的效价显著高于杂交瘤细胞上清的抗体效价,最高可达到1:102400。经过Western Blot分析可知两种单克隆抗体均能与天然纯化的β毒素发生特异性反应,而与其他的毒素不发生反应。单克隆抗体具有生物活性单一、纯度高、与抗原结合的特异性强等优点,我们可以用单克隆抗体很快的检测疾病及治疗疾病。进而将制备的抗β毒素单克隆抗体通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western-blot)实验进一步验证了抗β毒素单克隆抗体的纯度和反应原性。为下一步快速构建有效检测产气荚膜梭菌毒素类型的检测技术方法奠定了基础。该方法在疫病快速检测、食品安全等方面具备很好的应用前景。

关键词：产气荚膜梭菌 β-毒素单克隆抗体构建ELISA诊断技术梭菌病诊断

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产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体的制备及鉴定

产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体的制备及鉴定

作者：刘萌萌山东农业大学

学位级别：硕士

产气荚膜梭菌能产生多种致死性毒素,对多种动物的生命健康构成威胁,给我国畜牧业造成严重的损失。β毒素是该菌产生的一种毒性较强的毒素,具有强烈的细胞毒性、致死性和神经毒性,可引起动物和人的坏死性肠炎。C型产气荚膜梭菌产生的主... 详细信息

产气荚膜梭菌能产生多种致死性毒素,对多种动物的生命健康构成威胁,给我国畜牧业造成严重的损失。β毒素是该菌产生的一种毒性较强的毒素,具有强烈的细胞毒性、致死性和神经毒性,可引起动物和人的坏死性肠炎。C型产气荚膜梭菌产生的主要致死性毒素即为β毒素,但是培养C型菌产生的β量比较少,而且还含有少量α毒素,且分离开它们比较困难。鉴于上述原因,本研究利用实验室构建的原核表达体系制备了重组的β毒素,并通过Ni-Agarose His标签蛋白纯化柱纯化毒素,最终得到了β毒素蛋白。本研究利用重组的β毒素来免疫BALB/c鼠,时机成熟后取其脾脏细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0相融合,并挑选出阳性的单克隆杂交瘤细胞株。扩大培养后腹腔注入小鼠体内,待小鼠产生腹水后,取出腹水,并用正辛酸-硫酸铵纯化方法进行纯化,从而获得产气荚膜梭菌毒素单克隆抗体。本研究成功得到了三株单克隆抗体,分别命名为1E6、2C8和1E3。对得到的三株单抗进行各种鉴定后结果显示,杂交瘤细胞的培养上清及小鼠腹水中单抗的效价都相当高,最高可达到1:51200。而且特异性好与其他毒素均不能发生反应。经Western Blot分析可知三种单克隆抗体均能与重组β毒素和天然粗提的β毒素发生特异性反应。单克隆抗体具备性质单一、纯度较高、特异性强等优点,故我们可以用单克隆抗体检测疾病及治疗疾病。产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体的制备,为进一步建立快速有效的临床检测技术方法奠定了基础,而且在公共卫生、疫病检测方面具有良好的应用和推广前景。

关键词：产气荚膜梭菌 β-毒素单克隆抗体构建诊断技术

产气荚膜梭菌α-β融合基因的构建与表达研究

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安徽农业科学 2006年第19期34卷 4854-4856页

作者：马同锁李翠莲赵士豪张红兵赵宝华河北经贸大学生物科学与工程学院河北石家庄050061 秦皇岛教育学院河北秦皇岛066000 河北师范大学生命科学学院河北石家庄050016

应用PCR技术,首先从A型产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中扩增出α-毒素保护性抗原基因片段,然后从C型产气荚膜梭菌C58-1染色体基因组中扩增了930 bp的β-毒素基因,并将α-毒素基因和β-毒素基因插入融合表达载体pBV221中,获得了重组质粒pMCP... 详细信息

应用PCR技术,首先从A型产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中扩增出α-毒素保护性抗原基因片段,然后从C型产气荚膜梭菌C58-1染色体基因组中扩增了930 bp的β-毒素基因,并将α-毒素基因和β-毒素基因插入融合表达载体pBV221中,获得了重组质粒pMCPAB,转化受体菌BL21(DE3),得到重组菌株BL21(DE3)(pMCPAB)。对重组菌株诱导的表达产物进行ELISA检测和SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达α-β融合蛋白。免疫实验表明,表达产物免疫的小鼠可抵抗α-毒素和β-毒素的攻击。

关键词：产气荚膜梭菌 α-毒素 β-毒素融合基因基因表达

表达CPB-ST融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

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中国兽医科技 1998年第12期28卷 20-22页

作者：王玉炯许崇波冯书章朱平殷震宁夏农学院解放军农牧大学军事兽医研究所

已构建的能表达产气荚膜梭菌β毒素（ＣＰＢ）和大肠埃希氏菌ＳＴ融合蛋白（ＣＰＢＳＴ）的基因工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＥＣＢＳＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌株中提取的包涵体... 详细信息

已构建的能表达产气荚膜梭菌β毒素（ＣＰＢ）和大肠埃希氏菌ＳＴ融合蛋白（ＣＰＢＳＴ）的基因工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＥＣＢＳＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌株中提取的包涵体和经甲醛灭活的工程菌株全菌体制备抗原免疫小白鼠，攻毒试验结果表明，免疫小白鼠能分别抵抗１ＭＬＤ的Ｂ型产气荚膜梭菌强毒株（Ｃ５８－１）和产ＳＴ的大肠埃希氏菌工程菌株ＨＢ１０１（ｐＳＬＭ００４）的攻击。用灭活的全菌体免疫家兔后，其免疫血清能中和产气荚膜梭菌β毒素和大肠埃希氏菌ＳＴ的毒素活性。结果表明，构建的基因工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＥＣＢＳＴ１）可以作为预防由产气荚膜梭菌β毒素和大肠埃希氏菌ＳＴ引起的幼畜腹泻的基因工程苗侯选菌株。

关键词： β-毒素工程菌 CPB-ST 融合蛋白免疫原性