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采用蛋白质工程技术将αb-晶状体蛋白导入心肌细胞的初步研究

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生物化学与生物物理进展 2002年第2期29卷 283-287页

作者：蒋磊刘双袁灿肖卫民王慷慨尢家騄肖献忠中南大学湘雅医学院病理生理学教研室长沙410078

为将αb 晶状体蛋白 (αb crystallin ,αb C)导入心肌细胞 ,采用蛋白质工程技术将人αb 晶状体蛋白全长cDNA基因克隆至具有细胞膜通透能力的膜移位序列 (membrane translocatingsequence,MTS)的碱基顺序的下游 ,在大肠杆菌中表达谷胱甘... 详细信息

为将αb 晶状体蛋白 (αb crystallin ,αb C)导入心肌细胞 ,采用蛋白质工程技术将人αb 晶状体蛋白全长cDNA基因克隆至具有细胞膜通透能力的膜移位序列 (membrane translocatingsequence,MTS)的碱基顺序的下游 ,在大肠杆菌中表达谷胱甘肽 5 转移酶 (GST) MTS αb C融合蛋白 .用谷胱甘肽 Sepharose4b亲和层析分离表达产物 ,用Xa因子将其中GST切除 ,并通过阴离子交换层析纯化MTS αb C .纯化的MTS αb C在SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)上呈单一条带 ,分子质量 2 3ku ;免疫印迹显示GST MTS αb C与MTS αb C均能为人αb C抗体识别而在相应位置出现清晰条带 .GST MTS αb C与MTS αb C均有分子伴侣活性 .用异硫氰荧光素 (FITC)标记的MTS αb C与心肌细胞共培养后 ,在荧光显微镜下观察到其进入了心肌细胞 .

关键词： αb-晶状体蛋白蛋白质工程膜移位序列心肌细胞心肌损伤分子机制

αb-晶状体蛋白对急性高眼压大鼠视网膜神经节细胞保护作用机制的研究

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眼科新进展 2015年第4期35卷 318-322页

作者：马艳吴志鸿司南周立冬韩毳王立华武警总医院眼科北京市100039

目的研究αb-晶状体蛋白对钾离子通道kv1.1、kv1.3及凋亡抑制因子bcl-xl和凋亡因子Caspase-3的影响,探讨αb-晶状体蛋白对急性高眼压大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGC)保护作用的机制。方法 60只SD大鼠随机分为A组(急... 详细信息

目的研究αb-晶状体蛋白对钾离子通道kv1.1、kv1.3及凋亡抑制因子bcl-xl和凋亡因子Caspase-3的影响,探讨αb-晶状体蛋白对急性高眼压大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGC)保护作用的机制。方法 60只SD大鼠随机分为A组(急性高眼压组)、b组(急性高眼压+玻璃体内注射生理盐水5μL组)、C组(急性高眼压+玻璃体内注射10×10-6 g·L-1αb-晶状体蛋白5μL组),每组20只,右眼为实验眼。注射后7 d和14 d时,应用Western blot和实时定量逆转录聚合酶链反应(QRT-PCR)法检测kv1.1、kv1.3、bcl-xl和Caspase-3在视网膜上的表达水平。结果注射后7 d和14 d时,C组kv1.1、kv1.3通道蛋白和凋亡因子Caspase-3蛋白表达水平和mRNA相对表达量均较A组、b组低,差异均有统计学意义(均为Pbcl-xl蛋白表达水平和mRNA相对表达量较A组、b组高,差异均有统计学意义(均为Pb组间两两比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论αb-晶状体蛋白通过抑制急性高眼压后RGC上钾离子通道kv1.1、kv1.3的表达,从而提高凋亡抑制因子bcl-xl的表达、降低凋亡因子Caspase-3的表达,减少细胞凋亡,保护RGC。

关键词： αb-晶状体蛋白急性高眼压视网膜神经节细胞钾离子通道 bcl-xl Caspase-3

αb-晶状体蛋白在保护过氧化氢所致心肌细胞损伤中的作用

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湖南医科大学学报 2000年第3期25卷 223-226页

作者：肖卫民袁开宇肖献忠尢家騄钟林长沙湖南医科大学病理生理学教研室410078

采用热休克对新生大鼠心肌细胞进行预处理 ,以诱导αb 晶状体蛋白的表达 ,并观察其对 1mmol·L- 1 的过氧化氢 (H2 O2 )所致心肌细胞损伤的保护作用。发现 :热休克预处理组心肌细胞中αb 晶状体蛋白表达明显增加 ,H2 O2 所致的细胞死亡... 详细信息

采用热休克对新生大鼠心肌细胞进行预处理 ,以诱导αb 晶状体蛋白的表达 ,并观察其对 1mmol·L- 1 的过氧化氢 (H2 O2 )所致心肌细胞损伤的保护作用。发现 :热休克预处理组心肌细胞中αb 晶状体蛋白表达明显增加 ,H2 O2 所致的细胞死亡率及LDH释放率降低 ,总抗氧化能力增强 ;H2 O2 可引起αb 晶状体蛋白从胞浆向胞核及微丝移位。提示热休克预处理的心肌细胞保护作用与其诱导αb 晶状体蛋白的表达增加有关。αb 晶状体蛋白可能通过细胞内移位 ,保护某些核结构 ,稳定细胞骨架 ,并增强心肌细胞抗氧化能力。

关键词：心肌损伤过氧化氢 αb-晶状体蛋白

αb-晶状体蛋白在不同周龄正常大鼠晶状体中的表达

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αB-晶状体蛋白在不同周龄正常大鼠晶状体中的表达

作者：刘志涛吉林大学

学位级别：硕士

自由基损伤是各种因素导致白内障形成的共同途径，晶状体上皮细胞（lens epithelium cells，LECs）过度凋亡及晶状体蛋白的氧化损伤、翻译后修饰（post translational modifications, PTM）是白内障发病机制中的重要环节。足够质和量的... 详细信息

自由基损伤是各种因素导致白内障形成的共同途径，晶状体上皮细胞（lens epithelium cells，LECs）过度凋亡及晶状体蛋白的氧化损伤、翻译后修饰（post translational modifications, PTM）是白内障发病机制中的重要环节。足够质和量的水溶性蛋白，是维持晶状体透明性及屈光作用的基础。 α-晶状体蛋白作为晶状体内含量最高的组分，其分子伴侣活性在人的一生中发挥着极其重要的作用，α-晶状体蛋白的两种亚单位都具有分子伴侣（molecular chaperone）的效应。αb-晶状体蛋白广泛表达于多种组织细胞中，以晶状体和横纹肌（心肌和骨骼肌）表达量最高。在晶状体中，αb-晶状体蛋白与αA-晶状体蛋白以1:3的方式组成四聚体，发挥其生物学作用。αb-晶状体蛋白的基本功能是识别并结合有聚集倾向的非天然蛋白质或蛋白质折叠过程中的中间产物，稳定靶蛋白分子的构象，防止形成不可逆的蛋白质聚集产物。因此，αb-晶状体蛋白对细胞内蛋白质的数量和质量的稳定以及细胞内环境的稳定有着十分重要的作用，近年来我们发现αb-晶状体蛋白参与多种细胞生理和应激过程，表现出某种抗组织细胞损伤的保护功能。本实验研究结果表明，αb-晶状体蛋白的分子量大约为23.5KDa;不同周龄正常Wistar大鼠晶状体中可溶性的αb-晶状体蛋白的含量随着周龄的增加呈明显下降趋势。据此，我们推测，在晶状体的老化过程中，αb-晶状体蛋白受到各种致病因素造成的氧化性损伤及翻译后修饰的作用，造成分子内部和其他晶状体蛋白单位之间聚集最终形成不溶于水的高分子量聚合物。而αb-晶状体蛋白及其他具有分子伴侣活性的晶状体蛋白作为重要的结构蛋白，其水溶性的丧失或者下降本身就会引起晶状体的透明性及屈光作用的下降。同时晶状体内部存在的多种蛋白质水解酶体系，如calpain家族、Caspase家族等内切肽酶，DPPII、DPPIII等所代表的多种外切肽酶随着随着年龄增长，被激活或活性增强，这可促使以αb-晶状体蛋白为主的具有分子伴侣活性的晶状体蛋白被降解大小不等的片段或者单个氨基酸残基，这种效应最终和氧化性损伤、翻译后修饰和高分子量聚合物的形成引起分子伴侣活性下降的效应联合作用，使其保护其他可溶性结构蛋白（β-和γ-晶状体蛋白等）避免氧化损伤及翻译后修饰的作用下降。最终的结果就是晶状体内水溶性蛋白逐步向非水溶相转变，造成晶状体透明性及屈光作用的降低，导致白内障的形成及视力障碍。

关键词： αb-晶状体蛋白晶状体年龄相关性白内障 Western blot

αb-晶状体蛋白在毕赤酵母中的表达、纯化及活性测定

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αB-晶状体蛋白在毕赤酵母中的表达、纯化及活性测定

作者：高香西南大学

学位级别：硕士

αb-晶状体蛋白在晶状体内含量最高,作为小分子热休克蛋白家族,具有分子伴侣活性功能,并能防止蛋白积聚,起到保护细胞的作用。α-晶状体蛋白是负调节蛋白,可以阻止和缓解应激细胞和视网膜感光细胞的凋亡,保护视神经。最近的研究显示,年... 详细信息

αb-晶状体蛋白在晶状体内含量最高,作为小分子热休克蛋白家族,具有分子伴侣活性功能,并能防止蛋白积聚,起到保护细胞的作用。α-晶状体蛋白是负调节蛋白,可以阻止和缓解应激细胞和视网膜感光细胞的凋亡,保护视神经。最近的研究显示,年龄相关性黄斑变性、青光眼视神经病变、视网膜缺血再灌注损伤、视网膜营养不良、糖尿病视网膜病变、视网膜撕裂和神经系统多发性硬化、Parkinson’s、Creutzfeldt-Jakob等病变都与αb-晶体蛋白有关。另外,研究显示,αb-晶状体蛋白还与阿尔茨海默症脑内纤维缠结有关系,但机制尚不清楚。因此,为了进一步研究其结构和生理功能,需得到纯度与活性较高的αb-晶状体蛋白。由于从生物提纯的α-晶状体蛋白中分离完整的αb-晶体蛋白具有一定的技术难度,而且α-晶体蛋白来源受限,产量较低,浓度和纯度差异大,限制其开发应用。随着蛋白质重组技术的发展和重组多肽类药物在临床中的应用,αb-晶体蛋白已经在大肠杆菌表达系统和哺乳动物细胞中得以表达,但得到的重组蛋白产量低,而且大肠杆菌表达系统表达的重组蛋白需经复性才能得到有活性的蛋白,代价昂贵。因此,我们通过毕赤酵母表达系统表达αb-晶状体蛋白,从而进行高通量生产,达到降低生产成本并提高产率的目的,也为αb-晶状体蛋白在后续基础研究以及临床试验研究中提供基础,后续我们还将通过改变其结构,以期得到更高活性的重组蛋白。本课题中,人工合成αb-晶状体蛋白的全长基因（CRYAb）,并在基因序列的3’端引入了 His 6标签,之后将目的基因克隆到表达载体pPIC9K上,成功构建出CRYAb/pPIC9K重组质粒。然后,将构建的重组质粒通过电转的方法转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,阳性菌株小量表达后经SDS-PAGE电泳检测,获得高表达的αb-晶状体蛋白毕赤酵母菌株。在此过程中,用单因素实验方法优化了毕赤酵母菌株表达过程中的四个因素:甲醇补加量、转接比、发酵时间和通气量,获得一个较优的发酵表达条件:补加甲醇量为每12小时补加至终浓度为0.5%,3:1的转接比,84小时表达时间。通过甲醇诱导表达获得重组αb-晶状体蛋白,经Western blot鉴定,确定其分子量约为43KD。经过Q Sepharose Fast Flow柱纯化,再经G-75 Sephadex凝胶过滤后,最终可从每升发酵液中获得30-40mg目的蛋白,并利用胰岛素还原法对重组a b-晶状体蛋白进行了分子伴侣活性测定,结果显示重组αb-晶状体蛋白能明显抑制还原剂DTT引起的胰岛素b链聚集沉积反应,说明重组αb-晶状体蛋白具有分子伴侣活性。

关键词： αb-晶状体蛋白巴斯德毕赤酵母表达条件优化分子伴侣活性测定

αb-晶状体蛋白对大鼠急性高眼压后视网膜神经节细胞存活及凋亡蛋白Caspase-3表达的影响

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αB-晶状体蛋白对大鼠急性高眼压后视网膜神经节细胞存活及凋亡蛋...

作者：汪腊一辽宁医学院

学位级别：硕士

目的观察αb-晶状体蛋白对大鼠急性高眼压后视网膜神经节细胞存活及凋亡蛋白Caspase-3表达的影响。方法 3月龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重250±20g ,160只完全随机设计分成以下4组:A组(急性高眼压组),b组(急性高眼压+玻璃体穿刺... 详细信息

目的观察αb-晶状体蛋白对大鼠急性高眼压后视网膜神经节细胞存活及凋亡蛋白Caspase-3表达的影响。方法 3月龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重250±20g ,160只完全随机设计分成以下4组:A组(急性高眼压组),b组(急性高眼压+玻璃体穿刺组),C组(急性高眼压+玻璃体注射生理盐水组),D组(急性高眼压+玻璃体注射αb-晶状体蛋白组),应用荧光金逆行标记计数法、免疫荧光法观察急性高眼压后各组大鼠视网膜神经节细胞在不同时间点的存活率及凋亡蛋白Caspase-3表达情况。结果急性高眼压后实验动物右眼(实验眼)视网膜神经节细胞开始减少,低倍荧光显微镜下可见全视网膜节细胞均在减少,第一周减少最为明显,两周后减少放缓。与其它3组相比,D组在急性高眼压后1周、2周、3周、4周视网膜神经节细胞存活率明显提高,差异具有统计学意义(P0.05);急性高眼压后实验动物右眼(实验眼)Caspase-3免疫荧光染色出现阳性表达,与其它3组相比,D组在急性高眼压后24小时、48小时、72小时、1周的Caspase-3表达明显减少,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 αb-晶状体蛋白对大鼠急性高眼压后视网膜神经节细胞存在保护作用,能增加视网膜神经节细胞的存活率。 αb-晶状体蛋白能抑制急性高眼压后视网膜神经节细胞内凋亡蛋白Caspase-3的表达,减少细胞凋亡。

关键词： αb-晶状体蛋白急性高眼压 Caspase-3 视网膜神经节细胞

αb-晶状体蛋白在大鼠心肌缺血预适应早期相中的作用

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湖南医科大学学报 2000年第3期25卷 219-222页

作者：黄勤肖卫民尢家騄肖献忠钟林长沙湖南医科大学病理生理学教研室410078

以大鼠Langendorff离体灌流心脏为模型 ,观察αb 晶状体蛋白在预适应早期相保护阶段的变化。结果显示 :经缺血预处理后胞浆中可溶性αb 晶状体蛋白迅速移位至细胞内的不溶性结构中 ,15min ,30min逐渐复位 ,6 0min时已接近全部复位。经... 详细信息

以大鼠Langendorff离体灌流心脏为模型 ,观察αb 晶状体蛋白在预适应早期相保护阶段的变化。结果显示 :经缺血预处理后胞浆中可溶性αb 晶状体蛋白迅速移位至细胞内的不溶性结构中 ,15min ,30min逐渐复位 ,6 0min时已接近全部复位。经预适应后的心肌对缺血再灌流损伤的耐受性明显增强 ,表现为心肌收缩力及冠脉流量明显高于缺血再灌损伤组 ,肌酸磷酸激酶释放率及心肌丙二醛 (MDA)含量明显低于缺血再灌损伤组。提示缺血预适应使αb 晶状体蛋白迅速移位于细胞内不溶性结构 ,为αb

关键词：缺血预适应心肌缺血 αb-晶状体蛋白大鼠

大强度离心运动后骨骼肌αb-晶状体蛋白的表达特征研究

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北京体育大学学报 2011年第9期34卷 55-57页

作者：任秋君高前进单劲松冯国群石家庄学院体育系河北石家庄050035

通过观察αb-晶状体蛋白在骨骼肌细胞的变化,了解骨骼肌细胞抵抗运动损伤的机制。方法:成年雄性Wistar大鼠24只,随机分为安静对照组,运动后即刻组,运动后24 h组,每组8只,运动组进行一次性大强度离心运动;取腓肠肌制作冰冻切片,采用免疫... 详细信息

通过观察αb-晶状体蛋白在骨骼肌细胞的变化,了解骨骼肌细胞抵抗运动损伤的机制。方法:成年雄性Wistar大鼠24只,随机分为安静对照组,运动后即刻组,运动后24 h组,每组8只,运动组进行一次性大强度离心运动;取腓肠肌制作冰冻切片,采用免疫荧光组织化学法观察αb-晶状体蛋白在骨骼肌细胞的分布特征。结果:安静状态αb-晶状体蛋白在细胞浆有一定水平的表达,主要分布于胞浆及膜下。离心运动后即刻αb-晶状体蛋白表达增加并且发生移位变化,主要存在于Z盘及细胞膜附近,24 h后αb-晶状体蛋白在细胞膜和Z盘仍有大量分布。结论:离心运动后αb-晶状体蛋白从肌细胞胞浆移位于细胞膜和Z盘,其在骨骼肌可能具有防止Z盘和肌细胞膜骨架蛋白损伤或辅助骨架蛋白修复的作用。

关键词：离心运动 αb-晶状体蛋白骨骼肌细胞 Wistar大鼠

αb-晶状体蛋白、半乳糖凝集素-9与胰腺癌临床分期及预后的关系

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长治医学院学报 2021年第6期35卷 416-421页

作者：靖洁佳木斯中心医院消化内科 154002

目的:探究αb-晶状体蛋白(CRYAb)、半乳糖凝集素-9(Gal-9)与胰腺癌临床分期及预后关系。方法:选取胰腺癌患者56例为研究对象,均接受手术治疗。对术后病理组织进行免疫组化染色和蛋白免疫印迹法(Western blot)实验,比较胰腺癌组织和癌旁... 详细信息

目的:探究αb-晶状体蛋白(CRYAb)、半乳糖凝集素-9(Gal-9)与胰腺癌临床分期及预后关系。方法:选取胰腺癌患者56例为研究对象,均接受手术治疗。对术后病理组织进行免疫组化染色和蛋白免疫印迹法(Western blot)实验,比较胰腺癌组织和癌旁组织中CRYAb、Gal-9蛋白表达水平,分析CRYAb、Gal-9蛋白表达水平与胰腺癌患者临床病理参数及预后的关系。结果:免疫组化染色结果显示,胰腺癌组织中CRYAb蛋白(78.57%vs 5.36%)、Gal-9蛋白表达水平(39.29%vs 17.86%)显著高于癌旁组织(Pblot实验结果显示,胰腺癌组织中CRYAb蛋白(1.65±0.15 vs 0.66±0.07)、Gal-9蛋白表达水平(0.55±0.13 vs 0.17±0.02)显著高于癌旁组织(Pb蛋白表达水平高于高分化组(1.54±0.11 vs 0.88±0.03);有肿瘤远处转移组CRYAb蛋白表达水平高于无肿瘤远处转移组(1.37±0.16 vs 0.79±0.47);临床分期Ⅲ~Ⅳ期组胰腺癌组织中CRYAb蛋白表达水平高于临床分期Ⅰ~Ⅱ期组(1.58±0.19 vs 0.97±0.23,P蛋白表达水平(0.54±0.01 vs 0.38±0.02)显著高于无肿瘤远处转移组,临床分期Ⅲ~Ⅳ期组胰腺癌组织中Gal-9蛋白表达水平高于临床分期I~Ⅱ期组(0.56±0.02 vs 0.35±0.01,Pb蛋白高表达组术后3年总生存率显著低于低表达组(20.45%vs 58.33%,P蛋白高表达组术后3年总生存率显著低于低表达组(18.18%vs 47.06%,Pb蛋白高表达、Gal-9蛋白高表达是影响胰腺癌术后3年总生存率的危险因素(Pb与Gal-9在胰腺癌组织中呈高表达,与胰腺癌患者临床分期及预后关系密切。

关键词： αb-晶状体蛋白半乳糖凝集素-9 胰腺癌临床分期预后相关性