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α-芋螺毒素MIA和MIB特异性阻断肌肉型乙酰胆碱受体研究

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药学学报 2022年第3期57卷 724-730页

作者：吴茜茜王柳珺朱晓鹏长孙东亭吴勇罗素兰海南大学热带生物资源教育部重点实验室海南大学药学院海南海口570228 广西大学医学院广西南宁530004

α-芋螺毒素是从海洋软体动物芋螺毒液中发现的多肽类毒素,能够特异作用于各种不同亚型烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)。nAChRs在调节神经递质释放、细胞兴奋性等方面发挥重要生理功能。因为nAChRs功能异常与多种疾病密切相关,所以α-芋螺... 详细信息

α-芋螺毒素是从海洋软体动物芋螺毒液中发现的多肽类毒素,能够特异作用于各种不同亚型烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)。nAChRs在调节神经递质释放、细胞兴奋性等方面发挥重要生理功能。因为nAChRs功能异常与多种疾病密切相关,所以α-芋螺毒素可以开发为研究nAChRs的分子探针或直接作为先导药物进行开发。前期,研究人员从幻芋螺中发现的4种α-3/5型芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC,但MIA和MIB对不同亚型的nAChRs阻断活性及选择性还没有深入研究,本研究通过9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相法合成了α-芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC,并利用电生理技术对它们抑制不同亚型鼠源nAChRs的活性进行系统测定,结果表明MIA和MIB是肌肉型乙酰胆碱受体拮抗剂,半阻断剂量(IC_(50))分别是14.45和72.78 nmol·L^(-1),稍弱于MI与MIC,且对其他神经型nAChRs阻断活性微弱。分子对接研究显示, MIA和MIB与肌肉型nAChRs作用机制类似, N-端氨基酸序列差异是其活性差异的主要原因。本研究表明,芋螺毒素MIA和MIB有潜力发展成为检测肌肉型nAChRs功能以及诊断或治疗相关疾病的工具药物。

关键词：幻芋螺 α-芋螺毒素 9-芴甲氧羰基固相合成法氧化折叠肌肉型乙酰胆碱受体分子对接

α-芋螺毒素与乙酰胆碱结合蛋白共结晶的结构特点

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中国生物化学与分子生物学报 2016年第12期32卷 1313-1319页

作者：林波刘坤李孟森海南医学院海南省肿瘤发生与干预重点实验室海口571199

烟碱型乙酰胆碱受体(n AChRs)是配体门控离子通道,它与疼痛、阿尔茨海默氏病、成瘾等疾病密切相关。α-芋螺毒素是n AChRs的拮抗剂,也是治疗上述疾病的先导药物。乙酰胆碱结合蛋白(ACh BPs)与n AChRs的配体结合结构域同源性较高,它们的... 详细信息

烟碱型乙酰胆碱受体(n AChRs)是配体门控离子通道,它与疼痛、阿尔茨海默氏病、成瘾等疾病密切相关。α-芋螺毒素是n AChRs的拮抗剂,也是治疗上述疾病的先导药物。乙酰胆碱结合蛋白(ACh BPs)与n AChRs的配体结合结构域同源性较高,它们的药理特性和离子通道激活机制也相类似,α-芋螺毒素与ACh BPs共结晶结构解析了α-芋螺毒素残基如何选择结合n AChRs。现对α-芋螺毒素与ACh BPs共结晶结构进行综述,旨在剖析α-芋螺毒素与n AChRs相互作用的关键残基,为开发药效更好的芋螺毒素提供参考依据。

关键词： α-芋螺毒素烟碱型乙酰胆碱受体乙酰胆碱结合蛋白结晶结构关键残基

4-羟基脯氨酸立体异构对α-芋螺毒素溶液构象的影响(英文)

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物理化学学报 2013年第5期29卷 1080-1087页

作者：张兵兵赵聪王雪松何蕾杜为红中国人民大学化学系北京100872

在α-芋螺毒素及其它家族的芋螺毒素中,脯氨酸的羟基化是非常普遍的后转录修饰方式.在天然芋螺毒素中脯氨酸的羟基常采用反式构型,且该残基对芋螺毒素的结构与生物活性产生了重要的影响,而顺式构型的羟脯氨酸对α-芋螺毒素的折叠与生物... 详细信息

在α-芋螺毒素及其它家族的芋螺毒素中,脯氨酸的羟基化是非常普遍的后转录修饰方式.在天然芋螺毒素中脯氨酸的羟基常采用反式构型,且该残基对芋螺毒素的结构与生物活性产生了重要的影响,而顺式构型的羟脯氨酸对α-芋螺毒素的折叠与生物活性的影响还鲜有研究.本工作通过二维(2D)溶液核磁共振方法测定了经过化学修饰的三个含有反式或顺式羟脯氨酸的α-芋螺毒素的溶液结构,它们是α4/7亚家族芋螺毒素肽[γ15E]Sr1B、[O7O/γ15E]Sr1B和[O6O/γ14E]Vc1A.研究表明,羟基顺反异构化学修饰对芋螺毒素的结构影响显著.羟脯氨酸羟基的反式到顺式修饰导致α-芋螺毒素肽明显的溶液构象变化,这些变化包括二级结构的改变、关键残基的侧链取向变化以及氢键性质的改变.[O7O/γ15E]Sr1B与[γ15E]Sr1B相比,典型的α-芋螺毒素ω弯曲结构发生形变.而[O6O/γ14E]Vc1A不同于Vc1A的是末端转角结构的缺失.本工作加深了对α-芋螺毒素肽的化学修饰法的理解,该方法是阐明α-芋螺毒素结构-生物活性关系的有用工具.

关键词： α-芋螺毒素羟脯氨酸立体异构核磁共振溶液构象

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α-芋螺毒素构效关系的研究进展

军事医学科学院院刊 2006年第4期30卷 389-393页

作者：魏娟娟戴秋云军事医学科学院生物工程研究所北京100071

α-芋螺毒素（α—CTX）是芋螺毒素的重要家族，由12～19个氨基酸、2～3对二硫键组成，是迄今发现的最小的神经肽类毒素。α-芋螺毒素能特异性地抑制肌肉型或神经元型的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR），并能进一步区分不同的神经元型nACh... 详细信息

α-芋螺毒素（α—CTX）是芋螺毒素的重要家族，由12～19个氨基酸、2～3对二硫键组成，是迄今发现的最小的神经肽类毒素。α-芋螺毒素能特异性地抑制肌肉型或神经元型的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR），并能进一步区分不同的神经元型nAChR亚型。由于其相对分子质量小、活性高，不仅可直接开发为疗效特异的镇痛及抗癫痫等药物，还可作为研究神经生物学工具，鉴定nAChR亚型功能。本文对α—CTX研究的最新进展予以评述，着重介绍了α—CTX的作用靶位特性、构效关系及其应用进展。

关键词： α-芋螺毒素乙酰胆碱受体,烟碱竞争性拮抗剂构效关系

α-芋螺毒素Lt1.1的克隆、合成及靶点鉴定

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军事医学 2017年第5期41卷 334-337页

作者：宁胡莹李靓张龙霄刘珠果戴秋云军事医学科学院生物工程研究所北京100071

目的发现作用于神经元烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的拮抗剂,为研制新型镇痛药和神经生物学工具奠定基础。方法根据芋螺毒素A超家族DNA中保守的内含子及3'端非转录区(3'UTR)设计引物,从中国南海信号芋螺(Conus litteratus)中克隆获得新芋... 详细信息

目的发现作用于神经元烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的拮抗剂,为研制新型镇痛药和神经生物学工具奠定基础。方法根据芋螺毒素A超家族DNA中保守的内含子及3'端非转录区(3'UTR)设计引物,从中国南海信号芋螺(Conus litteratus)中克隆获得新芋螺毒素Lt1.1序列。固相法合成Rink树脂肽,经裂解、空气氧化折叠、纯化后获得目的肽,利用两步氧化折叠法鉴定其二硫键连接方式。将神经元nAChR各亚基的cRNA在爪蟾卵母细胞中表达,利用双电极电压钳检测通道电流。结果获得一种新α-芋螺毒素Lt1.1序列(GCCSHPACNVNNPDICNH2),其二硫键连接方式为"C1-C3、C2-C4",作用靶点为nAChR α3β2和α3β4亚型,IC50分别为166.76和190.00nmol/L。结论 Lt1.1是一种典型的4/7型α-芋螺毒素,其选择性抑制了nAChR α3β2和α3β4亚型。

关键词： α-芋螺毒素 Lt1.1 克隆合成烟碱型乙酰胆碱亚型

α-芋螺毒素特异性结合受体-神经型烟碱乙酰胆碱受体的同源模建及功能预测

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中国生化药物杂志 2012年第3期33卷 213-216页

作者：赵雪娇姜山何娟孙美娜李晖哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室黑龙江哈尔滨150086

目的探讨神经型烟碱乙酰胆碱受体能被其竞争性拮抗剂α-芋螺毒素选择性阻断的机理。方法采用同源模建的方法构建神经型烟碱乙酰胆碱受体α-7亚型的三维空间结构,并利用分子对接的方法与已知空间构像的α-芋螺毒素对接。结果已构建的神... 详细信息

目的探讨神经型烟碱乙酰胆碱受体能被其竞争性拮抗剂α-芋螺毒素选择性阻断的机理。方法采用同源模建的方法构建神经型烟碱乙酰胆碱受体α-7亚型的三维空间结构,并利用分子对接的方法与已知空间构像的α-芋螺毒素对接。结果已构建的神经型烟碱乙酰胆碱受体α-7亚型结构合理,并与已知空间构像的α-芋螺毒素对接成功。结论传统的烟碱型乙酰胆碱受体拮抗剂缺乏专一性,而靶向神经元神经型烟碱乙酰胆碱受体的α-芋螺毒素种类多,特异性强,与不同亚单位组成的受体亲和力不同,应用潜力很大。

关键词：神经型烟碱乙酰胆碱受体 α-芋螺毒素同源模建分子对接

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α-芋螺毒素二硫键中插入小分子骨架探究

α-芋螺毒素二硫键中插入小分子骨架探究

作者：张宝建海南大学

学位级别：硕士

芋螺是我国南海特有的海洋资源,芋螺分泌的芋螺毒素(Conotoxins)是巨大的海洋药源宝库。α-芋螺毒素是人们最早发现且研究最多的一大类芋螺毒素,主要作用于烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptors,n ACh Rs)。n ACh Rs... 详细信息

芋螺是我国南海特有的海洋资源,芋螺分泌的芋螺毒素(Conotoxins)是巨大的海洋药源宝库。α-芋螺毒素是人们最早发现且研究最多的一大类芋螺毒素,主要作用于烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptors,n ACh Rs)。n ACh Rs作为人体内重要的一类受体,广泛分布于肌肉、中枢和外周神经系统等,与成瘾、疼痛、抑郁、运动、学习认知等多种疾病的发生有着密切的联系。而α-芋螺毒素对n ACh Rs各种亚型具有非凡的选择性。因此,α-芋螺毒素可开发为研究n ACh Rs各种亚型精细结构和生理药理学功能的分子探针,且具有治疗n ACh Rs相关疾病的重大潜力。二硫键对α-芋螺毒素肽的结构、药理活性、选择性等起决定性作用,在体内容易发生断裂和错配。因此如何简便高效的改造α-芋螺毒素二硫键减少其在体内发生异构是重要的科学问题。本课题对17种不同Loop构型的α-芋螺毒素的两对二硫键分别进行改造,共合成了41个类似物,得到了多个活性和选择性良好的产物。其中[A10L]Pn IA的[2,4]位改造产物活性的选择性提高,Ls IA[2,4]位的多种连接子改造产物活性均能够保持。构效关系分析得如下结论,Cys[2,4]可作为4/6型,4/7型α-芋螺毒素肽的小分子插入位点,而Cys[1,3]和[2,4]均可作为3/5型α-芋螺毒素二硫键的改造位点。本研究利用小分子骨架对α-芋螺毒素的二硫键进行插入修饰,快速高效的构建其活性构象。该方法不仅解决了芋螺毒素合成产率低、容易发生二硫键错配的缺点,还可以实现接入其它分子的目的。这对于芋螺毒素在作为荧光探针、靶向给药等方面的应用至关重要。该方法将为更多芋螺毒素的结构改造提供新方法和新思路,为芋螺毒素的开发提供理论与技术支持。

关键词： α-芋螺毒素乙酰胆碱受体二硫键改造连接子插入构效关系

α-芋螺毒素抗毒素制备及α-芋螺毒素对GABABR介导的Cav2.2作用研究

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α-芋螺毒素抗毒素制备及α-芋螺毒素对GABABR介导的Cav2.2作用研...

作者：陈荣芳广西医科大学

学位级别：硕士

目的:本论文期望制备α-芋螺毒素均一抗原或偶联载体抗原以制备高中和活性抗血清,为α-芋螺毒素中毒救治提供手段,此外发现新的作用于GABAR介导的Ca2.2的α-芋螺毒素。方法:本论文尝试通过三种方法制备MI或GI新的免疫抗原:第一是通过基... 详细信息

目的:本论文期望制备α-芋螺毒素均一抗原或偶联载体抗原以制备高中和活性抗血清,为α-芋螺毒素中毒救治提供手段,此外发现新的作用于GABAR介导的Ca2.2的α-芋螺毒素。方法:本论文尝试通过三种方法制备MI或GI新的免疫抗原:第一是通过基因工程方法设计了一种融合α-芋螺毒素GI基因、PADRE基因和破伤风毒素C片段基因(TTC)的原核表达载体,并实现了重组蛋白的表达与纯化得到重组蛋白;第二是利用化学合成方法先合成含炔基MI或GI线性肽,然后通过点击反应合成多分支肽;第三是在MI的序列中引入游离半胱氨酸,然后与BSA偶联;最后将制备的免疫原免疫BALB/c小鼠制备抗血清,测定血清的抗体滴度及其中和活性。此外,合成了一些新型α-芋螺毒素及其他一些作用于GABAR介导的Ca2.2的α-芋螺毒素N端苯甲酰化突变体,并通过膜片钳技术测定了其对GABAR介导的Ca2.2的抑制活性。结果:(1)构建了表达α-芋螺毒素GI与PADRE、TTC融合蛋白的大肠杆菌原核表达载体,表达纯化了该重组蛋白抗原GI-PADRE-TTC。(2)应用点击反应合成并纯化了MI、GI多分支肽抗原。(3)GI-PADRE-TTC蛋白第四次和第五次免疫后,抗体滴度均大于1:25600,而单独的PADRE-TTC载体蛋白抗血清未检测到阳性,中和活性结果显示100、200μl GI-PADRE-TTC蛋白抗血清对40μg/kg GI中毒小鼠的保护率为14.3%、25.0%,且小鼠死亡时间显著延长。(4)20μg/只剂量的N端连接的MI八分支肽第4次免疫后血清抗体滴度为1:6400,10、20μg/只剂量的C端连接MI八分支肽第4次免疫后血清抗体滴度为1:3200及1:25600,C端连接的GI多分支肽50μg/只第4次免疫后滴度仅为1:800,但上述GI或MI多分支肽免疫血清对MI(20μg/kg)、GI(40μg/kg)中毒小鼠无明显保护活性。(5)在MI的序列中引入游离半胱氨酸,线性肽折叠形成多种产物,无法得到含游离半胱氨酸MI与BSA偶联制备抗原;(6)合成了15条α-芋螺多肽并测定了其对GABAR介导的Ca2.2的抑制活性,结果发现:10μM浓度的Bt14.10、Bt14.14、Lt1.1、Liuna-7-I、和Liuna-7-II、Lt1.2、Liuna-18-I对GABAR介导的Ca2.2抑制活性低(11.28%～20.31%),10 n M Benzoyl-Rg IA、Benzoyl-Pe IA、Benzoyl-Pe IA[S9R]以及Benzoyl-Au IB-I以及Benzoyl-Au IB-II对GABAR介导的Ca2.2具有较高活性,抑制率分别为23.29±2.28%、17.72±2.73%、17.27±2.08%、24.92±2.51%及24.19±3.04%。未改造毒素的抑制活性正在测定中。结论:本论文探索了新型剧毒α-芋螺毒素MI和GI免疫抗原的制备方法,并对其制备的抗血清的中和活性进行了评价。实验结果表明:GI-PADRE-TTC融合蛋白抗血清对GI起到部分抗毒活性而GI和MI多分支抗原肽制备的抗血清不能保护中毒小鼠,另外,含游离半胱氨酸MI折叠产物无主峰,不能进行纯化及与BSA偶联。另一方面,我们也合成并测定了几种新型α-芋螺毒素对GABAR介导的Ca2.2的抑制活性。10μM浓度的新型毒素对GABAR介导的Ca2.2抑制活性均较弱,Rg IA和Au IB的N端苯甲酰化后突变体的活性仍很高。

关键词： α-芋螺毒素抗毒素制备 GABABR Cav2.2 抑制活性

α-芋螺毒素与烟碱型乙酰胆碱受体作用的药理学

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热带生物学报 2010年第1期1卷 78-84,89页

作者：吴勇朱晓鹏安婷婷长孙东亭罗素兰海南大学热带生物资源教育部重点实验室海南海口570228 海南大学海洋学院海南海口570228 海南大学材料与化工学院海南海口570228

芋螺毒素(CTX)来源于芋螺毒管分泌的毒液,是一类分子质量小、结构新颖、作用靶点广泛且特异性高的活性多肽,具有开发成为药物或药物先导化合物的价值。芋螺毒素按其作用靶点不同等特点可以分为多个家族,其中α-芋螺毒素家族(α-CTXs)的... 详细信息

芋螺毒素(CTX)来源于芋螺毒管分泌的毒液,是一类分子质量小、结构新颖、作用靶点广泛且特异性高的活性多肽,具有开发成为药物或药物先导化合物的价值。芋螺毒素按其作用靶点不同等特点可以分为多个家族,其中α-芋螺毒素家族(α-CTXs)的半胱氨酸模式为:CC-C-C。根据α-CTXs半胱氨酸残基间的氨基酸数目进一步分为不同的亚家族。α-CTXs是肌肉或神经型烟碱乙酰胆碱受体的选择性拮抗剂,具有重要临床意义的乙酰胆碱受体(nAChRs)与神经痛、帕金森病、痴呆、学习记忆障碍以及小细胞肺癌等多种疾病的发病、诊断和治疗密切相关。笔者详述了α-芋螺毒素与烟碱型乙酰胆碱受体的结构、分类及其相互间的作用关系,旨在为该类药物的开发利用提供参考依据。

关键词： α-芋螺毒素烟碱型乙酰胆碱受体结构分类相互作用