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黄柏苷化感作用的研究

黄柏苷化感作用的研究

作者：王晗北京协和医学院

学位级别：硕士

黄檗为传统中药关黄柏的基源植物,其野生种群存在自我更新障碍,种群中幼年植株稀少,作为珍稀濒危物种已经列入中国植物红皮书。本课题组以往的研究表明,黄檗自身的化感作用是导致其濒危的重要原因之一,对黄檗落叶进行化感活性成分的提... 详细信息

黄檗为传统中药关黄柏的基源植物,其野生种群存在自我更新障碍,种群中幼年植株稀少,作为珍稀濒危物种已经列入中国植物红皮书。本课题组以往的研究表明,黄檗自身的化感作用是导致其濒危的重要原因之一,对黄檗落叶进行化感活性成分的提取和分离,活性组分中的主要成分黄柏苷的化感作用未见报道,经初步筛选确定是一种新的化感物质。本论文主要就黄柏苷的化感作用进行研究,通过黄柏苷对黄檗及近缘种黄皮树种子萌发过程以及幼苗生长影响的研究,黄檗生长地域土壤中化感物质含量的3年跟踪测定,黄柏苷、黄檗落叶所含化感物质、黄檗落叶水浸液三者化感作用的比较,进一步确定黄柏苷的化感活性,评估黄柏苷在黄檗落叶化感效应中的作用,及落叶化感作用对黄檗野生种群幼苗形成的影响。以不同来源的黄檗种子和黄皮树种子作为受试对象,用不同浓度的黄柏苷溶液对后熟阶段及萌发阶段的黄檗及黄皮树种子进行处理,检测种子发芽率、发芽指数、幼苗株高及根的长度,通过各单项指标及综合性指标(幼苗活力指数)评价黄柏苷的化感效应。结果表明,低温后熟过程中,黄柏苷对黄檗种子的平均抑制分别为发芽率30.28%、发芽指数30.16%、幼苗株高17.93%、根长24.86%、活力指数40.35%。黄柏苷对黄皮树种子的平均抑制分别为发芽率30.70%、发芽指数32.34%、幼苗株高25.43%、根长26.14%、活力指数48.61%。萌发过程中,黄柏苷对黄檗种子的平均抑制分别为发芽率29.59%、发芽指数28.66%、幼苗株高23.41%、根长31.01%、活力指数43.67%。黄柏苷对黄皮树种子的平均抑制分别为发芽率39.09%、发芽指数38.42%、幼苗株高29.35%、根长32.11%、活力指数53.59%。高效液相色谱法检测证明,黄檗落叶中黄柏苷含量为5.34mg·g-1,化感物质6-甲氧基-7-羟基香豆素、伞形花内酯、山奈酚、槲皮素、山奈酚-3-0-β-D-葡萄糖苷及槲皮素-3-0-β-D-半乳糖苷的含量最高仅达0.0761mg·g-,黄柏苷含量远高于其他化感物质在落叶中的含量。高效液相法测定黄檗生长地域土壤中黄柏苷含量,发现含量与季节的变化有很大的关系,秋季至次年春季含量持续上升,最高可达45.11μg·g-1,夏季含量为一年中的最低。对黄柏苷、落叶化感物质、落叶水浸液三者化感作用的比较研究表明,对低温后熟过程,黄柏苷的化感作用大于落叶化感物质和落叶水浸液;对种子萌发过程,黄柏苷的化感作用大致与落叶化感物质相同。黄柏苷是影响黄檗种子萌发的主要化感物质,落叶中化感物质有相互作用,在有大量落叶腐解成分存在的黄檗种群或母树下的土壤中,落叶中的化感物质有可能通过影响黄檗种子的后熟解除和萌发过程,抑制黄檗幼苗的形成,影响幼苗的生长,致使幼苗数量稀少。

关键词：黄柏苷黄檗种子萌发化感作用含量测定

黄柏苷及绿原酸诱导A549细胞凋亡机制的研究

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黄柏苷及绿原酸诱导A549细胞凋亡机制的研究

作者：郭鹤云吉林大学

学位级别：硕士

癌症一直是人类健康的杀手,近年来,肺癌发病率仅次于乳腺癌和前列腺癌,已成为导致癌症死亡的主要原因。黄柏苷和绿原酸是黄檗树叶中的有效成分,作为天然产物,二者毒性较低且副作用少。本研究旨在探究黄柏苷和绿原酸的抗肿瘤活性及其分... 详细信息

癌症一直是人类健康的杀手,近年来,肺癌发病率仅次于乳腺癌和前列腺癌,已成为导致癌症死亡的主要原因。黄柏苷和绿原酸是黄檗树叶中的有效成分,作为天然产物,二者毒性较低且副作用少。本研究旨在探究黄柏苷和绿原酸的抗肿瘤活性及其分子机制,为癌症治疗寻找新型方案。利用不同浓度的黄柏苷和绿原酸分别处理A549细胞48小时,通过MTT法检测两种药物对细胞生长的抑制率,并利用流式细胞术分析两种药物处理后A549细胞周期分布及细胞凋亡情况。同时,通过比色法检测并比较了用药前后A549细胞内SOD活力、GSH含量、MDA含量以及caspase 3活性的变化;利用JC-1染色法,通过荧光显微镜观察了不同时间内黄柏苷和绿原酸对A549细胞线粒体膜电位的影响。此外,还通过免疫印迹分析了A549细胞内凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2的表达水平。通过MTT实验结果发现,药物浓度为2000μM时,黄柏苷对A549细胞的生长抑制率为70.87%,绿原酸对细胞的抑制率为29.01%。流式细胞术检测结果表明,黄柏苷可以诱导细胞周期停滞在G2/M期,并引起84.32%的细胞发生凋亡,而绿原酸将A549细胞周期阻滞在了S期,并造成30.10%的细胞发生凋亡。荧光显微镜观察结果显示,在24小时内,黄柏苷和绿原酸均能够降低A549细胞线粒体膜电位。此外,黄柏苷可以导致A549细胞内SOD活力下降50%,GSH含量降低30%,MDA含量增加60%,但绿原酸对此并无显著影响。而且,黄柏苷和绿原酸分别将A549细胞内caspase 3活性提高了31%和25%。免疫印迹结果表明,黄柏苷将细胞内Bax/Bcl-2水平上调为对照组的33倍,绿原酸则将Bax/Bcl-2水平上调为对照组的1.8倍。本研究发现,黄柏苷和绿原酸均可以通过阻滞细胞周期,损伤细胞遗传物质,上调Bax因子的表达,同时下调Bcl-2因子的表达,并且激活caspase 3进而诱导A549细胞凋亡。

关键词：黄柏苷绿原酸细胞凋亡细胞周期 Bax Bcl-2 caspase 3

黄檗叶提取物及黄柏苷对HepG2细胞的影响

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黄檗叶提取物及黄柏苷对HepG2细胞的影响

作者：刘欢欢吉林大学

学位级别：硕士

黄檗叶提取物（PLF）是一种从天然植物黄檗的叶子中提取得到的黄酮类化合物，黄柏苷是由PLF经制备液相分离纯化得到的单一结构化合物。本文主要研究PLF和黄柏苷对HepG2细胞内ROS的清除作用，凋亡、周期及分子机制的影响，具体结果如下：... 详细信息

黄檗叶提取物（PLF）是一种从天然植物黄檗的叶子中提取得到的黄酮类化合物，黄柏苷是由PLF经制备液相分离纯化得到的单一结构化合物。本文主要研究PLF和黄柏苷对HepG2细胞内ROS的清除作用，凋亡、周期及分子机制的影响，具体结果如下：本文首先利用流式细胞仪检测PLF和黄柏苷对HepG2细胞内ROS的清除作用。实验结果表明：当75ug/mL PLF和800ug/mL黄柏苷分别作用于HepG2细胞24小时后，细胞内ROS的水平与正常对照组相比分别为56.46%和53.9%,PLF和黄柏苷均能够清除HepG2细胞内的ROS。第二方面是利用流式细胞仪检测PLF和黄柏苷对HepG2细胞凋亡的影响。研究结果表明,PLF和黄柏苷均抑制HepG2细胞增殖，并呈剂量依赖性。当PLF和黄柏苷浓度达到1.5mg/mL时，二者对HepG2细胞的抑制率分别为90%和70%。最后本文利用流式细胞仪检测PLF和黄柏苷对HepG2细胞周期的影响，并探讨了其相关的分子机制。研究结果表明,当1mg/mL PLF作用HepG2细胞48小时后，与未用药细胞相比,HepG2细胞累积多于30%，细胞分裂停留在G1时期，而1.5mg/mL黄柏苷使HepG2细胞累积多余15%，细胞分裂停留在S期，并利用Western bolt的方法检验了CDK2蛋白因子。本课题组前期工作表明PLF能够抑制DNA拓扑异构酶的活性，阻止DNA的复制过程，而本研究证明HepG2细胞周期停滞在G1时期，这与本课题组前期的研究工作相符，说明了PLF抑制肿瘤细胞增殖的分子机制。本研究表明PLF和黄柏苷都具有抗氧化清除自由基的能力，同时能诱导HepG2细胞凋亡，黄柏苷能使HepG2细胞周期停滞在S时期，这可能与CDK2蛋白因子有关，相关研究正在进行。

关键词： PLF 黄柏苷细胞凋亡细胞周期 ROS

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黄柏苷对黄檗种子休眠程度影响的初步研究

中国农学通报 2018年第16期34卷 78-82页

作者：黄少雄段学伟张昭徐硕中国医学科学院北京协和医学院/药用植物研究所/中草药物质基础与资源利用教育部重点试验室北京100193

为研究黄柏苷与环境温度、种子休眠程度的相关性,探讨黄柏苷在温度信号介导中可能存在的作用。以高效液相法检测不同生长地及年度黄檗叶片中的黄柏苷含量,滤纸培养法检测黄檗种子发芽率确定其休眠程度。持续监测生长地气温。通过在黄檗... 详细信息

为研究黄柏苷与环境温度、种子休眠程度的相关性,探讨黄柏苷在温度信号介导中可能存在的作用。以高效液相法检测不同生长地及年度黄檗叶片中的黄柏苷含量,滤纸培养法检测黄檗种子发芽率确定其休眠程度。持续监测生长地气温。通过在黄檗繁殖器官上喷施黄柏苷,考察黄柏苷对种子休眠程度的直接影响。结果表明,生长地花期均温相差5℃,黄檗叶片中黄柏苷含量均值相差54.46 mg/g,层积30天种子发芽率相差40.45%;不同年度间花期均温相差1.16℃,黄柏苷含量均值相差4.83 mg/g,层积30天种子发芽率相差23.07%;喷施黄柏苷,可使种子休眠程度显著加深,种子发芽率降低57.34%。研究结果提示三者之间存在环境温度越低,黄檗叶片中黄柏苷含量越高,黄檗种子休眠程度越深的关联,温度对黄檗种子休眠程度的调控可能是通过调节黄柏苷含量,经过某种体内途径实现的。

关键词：环境温度黄柏苷黄檗种子休眠信号因子

以EGFR为靶标的非小细胞肺癌中药天然产物抑制剂的虚拟筛选

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中草药 2024年第21期 7230-7237页

作者：肖佳卓董斯睿许毛罗伦吴丰旭湖北医药学院药学院湖北医药学院武当特色中药研究湖北省重点实验室十堰市太和医院湖北医药学院附属医院抗衰老中心

目的从中药天然产物数据库中发现具有新颖骨架靶向表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）治疗非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的天然产物分子。方法通过使用一致性虚拟筛选方法，从中药天然... 详细信息

目的从中药天然产物数据库中发现具有新颖骨架靶向表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）治疗非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的天然产物分子。方法通过使用一致性虚拟筛选方法，从中药天然产物化合物库中筛选具有潜力的化合物分子，并进行酶活和细胞活性测试进行验证。结果从由527个小分子组成的中药天然产物化合物库中筛选出了4个在实验中对EGFR有抑制活性的化合物分子，其中化合物异槲皮苷（248）对野生型NSCLC细胞的抑制活性(IC50=0.016μmol/L)优于对照药剂吉非替尼(IC50=0.343μmol/L)，而化合物黄柏苷（376）不仅对野生型NSCLC细胞有抑制活性(IC50=18.725μmol/L)，并且对2种EGFR突变体细胞（L858R-T790M-C797S和del19-T790MC797S）有2倍左右的选择性，具有一定的抗耐药潜力。结论发现了4个对EGFR和NSCLC细胞有抑制活性的中药天然产物分子，为后续的结构改造和进一步得到更高效的EGFR小分子抑制剂提供参考，并为NSCLC药物的研发和临床研究奠定基础。

关键词：表皮生长因子中药天然产物虚拟筛选非小细胞肺癌异懈皮苷黄柏苷

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黄檗叶黄酮类提取物对酪氨酸酶的活性影响

黄檗叶黄酮类提取物对酪氨酸酶的活性影响

作者：崔萌吉林大学

学位级别：硕士

黑色素合成中的关键酶——酪氨酸酶(EC 1.***.18.1)是一种双核铜离子氧化酶,是多酚氧化酶的一种,广泛存在于微生物、动植物以及人体中。酪氨酸酶催化黑色素合成中的两步限速反应:酪氨酸羟化成左旋多巴和左旋多巴氧化成多巴醌,因此成为调... 详细信息

黑色素合成中的关键酶——酪氨酸酶(EC 1.***.18.1)是一种双核铜离子氧化酶,是多酚氧化酶的一种,广泛存在于微生物、动植物以及人体中。酪氨酸酶催化黑色素合成中的两步限速反应:酪氨酸羟化成左旋多巴和左旋多巴氧化成多巴醌,因此成为调控黑色素合成领域的研究重点,关于酪氨酸酶及酪氨酸酶活性调控的研究日益受到重视,吸引了大量研究者的兴趣。本论文主要研究了黄檗叶中黄酮提取物(PLF)和黄柏苷对酪氨酸酶活性的影响。本文一方面通过酪氨酸酶与PLF中主要成分的分子对接,推测PLF对酪氨酸酶有一定的抑制作用,并进行了相关的验证实验。通过紫外分光光度法、荧光猝灭法等,我们发现PLF是可逆的混合型抑制剂,IC50为0.1mg/mL,抑制常数Ki和Kis分别为455.99mM和95.67mM。PLF能够使酪氨酸酶的内源荧光产生剂量依赖的荧光猝灭,但最大峰位波长没有明显变化,确定了PLF对酪氨酸酶的抑制作用。另一方面,我们发现黄柏苷在不同pH条件下均使酪氨酸酶的活性增加,也使酪氨酸酶的内源荧光产生了剂量依赖的荧光猝灭,pH 6.24下猝灭常数Ksv=9.144E3L/mol,扩散猝灭速率常数Kq为9.144E11L·mol-1·s-1;pH7.17条件下猝灭常数Ksv=11.49E3L/mol,扩散猝灭速率常数Kq为11.49E11L·mol-1·s-1,说明黄柏苷对酪氨酸酶的荧光猝灭是这两种物质形成复合物引起的静态猝灭。其后我们制备了黄柏苷软膏,利用5%H2O2脱色法建立白癜风小鼠模型,并进行初步的的治疗实验,发现模型组较对照组含黑色素的毛囊数减少了10.12%,而黄柏苷组含黑色素的毛囊数较对照组减少了5.81%,说明了建模的成效及黄柏苷软膏对白癜风可能的治疗效果。本研究发现PLF是酪氨酸酶抑制剂,而黄柏苷对酪氨酸酶有一定的激活作用,与分子对接结果一致,为这两种物质在美白或白癜风治疗中的应用提供了一定的理论依据。

关键词：酪氨酸酶 PLF 黄柏苷黑色素

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黄檗落叶化感物质的初步研究

黄檗落叶化感物质的初步研究

作者：戴灵超北京协和医学院

学位级别：硕士

黄檗为芸香科黄檗属植物,是常用中药材关黄柏的基源植物。由于野生黄檗资源遭到严重破坏,并且通过野外调查发现黄檗种群自我更新不良,现已成为濒危物种。课题组早期研究证实黄檗果皮和落叶中均存在影响黄檗种子萌发和幼苗生长的物质。... 详细信息

黄檗为芸香科黄檗属植物,是常用中药材关黄柏的基源植物。由于野生黄檗资源遭到严重破坏,并且通过野外调查发现黄檗种群自我更新不良,现已成为濒危物种。课题组早期研究证实黄檗果皮和落叶中均存在影响黄檗种子萌发和幼苗生长的物质。本实验通过天然产物化学结合生物活性检测的研究方法,对黄檗落叶中存在的化感物质进行分离鉴定及活性检测,并对黄檗生长地域土壤中的化感物质含量进行了初步的探索。实验采用小麦种子作为受试植物进行活性筛选,通过天然产物化学的研究方法,从落叶中分离得到一个影响小麦和黄檗种子萌发及幼苗生长的物质,经波谱解析和文献比对,确定该化合物为黄柏苷。生物活性测定结果表明,黄柏苷能显著抑制小麦幼苗的生长,但是对小麦种子的萌发影响较小。黄柏苷在浓度大于0.4mg/ml时对黄檗种子的发芽率具有极显著抑制作用,在浓度大于0.2mg/ml时,能显著抑制黄檗种子发芽指数和活力指数,对黄檗幼苗的生长具有极显著的抑制作用,并随浓度的增加抑制作用加强。在自然环境中,黄檗落叶中的物质可能会随雨雪淋洗进入黄檗种子所处的土层中,黄檗种子低温后熟过程可能会受黄柏苷的影响。本实验在预处理黄檗种子时以黄柏苷的水溶液浸种再进行低温8℃处理。实验结果表明,黄柏苷溶液浸种低温处理的种子发芽率和发芽指数极显著低于蒸馏水浸种低温处理的种子发芽率和发芽指数,提示黄柏苷可能会影响黄檗种子的后熟过程。文献报道黄柏苷在黄檗属植物落叶中是一种含量较高的成分,实验测得北京地区黄檗落叶中黄柏苷的含量为12.12mg/g。黄檗落叶100mg/ml水浸液中黄柏苷的含量为0.89mg/ml,远高于其单体化合物在水中的溶解度。对黄檗生长地域土壤中黄柏苷的含量进行测定,结果表明10、11月份土壤中黄柏苷的含量较低,经过雨雪淋洗和冻土期后,3月份黄柏苷的含量有所升高。4月份黄柏苷的含量又出现下降。实验结果提示雨雪淋溶等方式,可能有助于落叶中的黄柏苷释放到土壤中通过对黄檗落叶中的化学成分进行分析,从中分离得到20个化合物,鉴定了其中18个化合物的结构。其中黄酮类化合物9个,香豆素类化合物7个,甾体化合物2个。通过波谱解析及文献比对确定这18个化合物的结构分别为：6-甲氧基-7-羟基香豆素(scopoletin,1):伞形花内酉旨(umbelliferon,2);phellodenol-A (3);neophellamuretin(4);山柰酚(kaempferol,5):槲皮素(quercetin,6):胡萝卜苷(daucosterol,7):山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(kaempfero-3-O-β-D-glucoside,8);槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷(quercetin-3-O-β-D-galactoside, 9);hexandraside E(10);6-(2'-羟基-3'-甲基-3'-丁烯基)香豆素-7-O-β-D-葡萄糖苷(7-O-β-D-glucopyranosyl-6-(2-hydroxy-3-methl-3-butenyl) coumarin,11);7-(3'-甲基-2'-己烯基-6'-O-β-D-葡萄糖基)香豆素(7-(6'-O-β-D-glucopyranosyl-3'-methyl-2'-hexenyl)coumarin,12);茵芋苷(skimmin,13);phellodenol E (14);黄檗苷(amurensin,15);黄柏苷(phellamurin,16);(2R)-phellodensin-F (17);clerosterol-3-O-β-D-galactopyranoside (18)。其中化合物化合物11、12为新化合物,化合物4、14、17为首次从黄檗中分离得到,化合物18为首次从黄檗属中分离得到。文献资料表明落叶中的化合物6-甲氧基-7-羟基香豆素;伞形花内酯;山柰酚：槲皮素：山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷：槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷都具有一定的化感作用,黄檗落叶中这些化合物能否产生化感作用,仍需对其量效关系进一步研究。结论：黄柏苷可能是黄檗落叶产生化感作用的化合物之一。

关键词：黄檗化感作用黄柏苷含量测定