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高渗应激对肝细胞癌Huh7细胞增殖和凋亡的影响

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中华实验外科杂志 2013年第3期30卷 497-499页

作者：龚铖李昌盛邴运韬刘伟军余国政刘权焰刘志苏武汉大学中南医院普通外科武汉430071

目的观察高渗应激对肝细胞癌Huh7细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其调控机制。方法免疫组织化学法检测64例肝细胞癌组织中渗透压调控的转录因子活化T细胞核因子5（NFAT5）的表达；氯化钠模拟肿瘤高渗微环境，Westernblot法检测NFAT5蛋白... 详细信息

目的观察高渗应激对肝细胞癌Huh7细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其调控机制。方法免疫组织化学法检测64例肝细胞癌组织中渗透压调控的转录因子活化T细胞核因子5（NFAT5）的表达；氯化钠模拟肿瘤高渗微环境，Westernblot法检测NFAT5蛋白的表达；流式细胞仪检测细胞凋亡；噻唑蓝（MTF）比色法检测细胞体外增殖活力。结果癌组织NFAT5的阳性表达率为9．38％，明显低于癌旁组织（68．75％，P〈0．01）。高渗24h组（100mmol／LNaCl）能使Huh7细胞NFAT5蛋白的表达显著升高（P〈0．01）。高渗24h组（100mmol／LNaCl）细胞凋亡率[（26．0±3．2）％]明显高于空白对照组[（0．8±0.2）％，P〈0．01]。高渗24h（100mmol／LNaCI）能明显抑制Huh7细胞增殖．细胞生长抑制率为（31．35±2．09）％（P〈0．01）。结论作为哺乳动物唯一的渗透压调节相关因子NFAT5，肝细胞癌组织与癌旁组织在NFAT5高表达率上差异有统计学意义，高渗应激能上调肝癌细胞NFAT5的表达，诱导肝癌细胞凋亡，并抑制细胞增殖。

关键词：癌肝细胞高渗应激脱噬作用增殖

p38丝裂原激活蛋白激酶信号通路参与高渗应激诱导黏蛋白5AC高表达研究

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环境与健康杂志 2010年第4期27卷 311-313页

作者：李文锋周向东重庆医科大学第二附属医院呼吸内科重庆400010

目的探讨p38丝裂原激活蛋白激酶(P38)信号通路参与高渗应激诱导黏蛋白5AC(MUC5AC)高表达的作用机制。方法利用545、695、855、1055和1280mOsm/L高渗氯化钠溶液培养人气道上皮NCl-H292细胞。同时以1280m Osm/L高渗氯化钠为刺激因素,以P3... 详细信息

目的探讨p38丝裂原激活蛋白激酶(P38)信号通路参与高渗应激诱导黏蛋白5AC(MUC5AC)高表达的作用机制。方法利用545、695、855、1055和1280mOsm/L高渗氯化钠溶液培养人气道上皮NCl-H292细胞。同时以1280m Osm/L高渗氯化钠为刺激因素,以P38特异性抑制剂SB203580、c-jun氨基末端激酶(JNK)特异性抑制剂SP600125及细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)特异性抑制剂U0126为干预因素,采用RT-PCR技术及ELISA观察培养细胞MUC5AC转录水平和MUC5AC蛋白水平改变。采用Western blotting法检测1280mOsm/L高渗氯化钠培养上清液中细胞匀浆磷酸化P38(p-P38)、磷酸化JNK(p-JNK)及磷酸化ERK(p-ERK)蛋白水平。结果分别以545、695、855、1055和1280mOsm/L高渗氯化钠刺激后,培养细胞中MUC5AC mRNA及蛋白含量显著高于对照组(P高渗氯化钠所致的p-P38含量升高,同时显著下调MUC5AC mRNA及蛋白含量(P高渗氯化钠对ERK的含量无影响(P>0.05),U0126对MUC5AC mRNA转录及蛋白含量也无明显影响(P>0.05)。结论高渗应激可呈浓度依赖性地从转录水平诱导气道上皮细胞呈现黏液高分泌状态,且P38信号通路起主要作用。

关键词：高渗应激 P38丝裂原激活蛋白激酶黏蛋白5AC 酶联免疫吸附测定

Hfq对伤寒沙门菌高渗应激早期的基因表达的调节

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Hfq对伤寒沙门菌高渗应激早期的基因表达的调节

作者：谢新民江苏大学

学位级别：硕士

目的:Hfq是细菌一种RNA分子伴侣,能够调节细菌很多基因尤其是毒力相关基因的表达,在伤寒沙门菌中,细菌在高渗应激条件下很多毒力相关基因表达改变。本研究的目的是探讨伤寒沙门菌Hfq调节因子在高渗应激条件下对基因表达的影响。方法:1.... 详细信息

目的:Hfq是细菌一种RNA分子伴侣,能够调节细菌很多基因尤其是毒力相关基因的表达,在伤寒沙门菌中,细菌在高渗应激条件下很多毒力相关基因表达改变。本研究的目的是探讨伤寒沙门菌Hfq调节因子在高渗应激条件下对基因表达的影响。方法:1.伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株制备。用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌hfq向基因缺陷变异株。根据伤寒沙门菌hfq基因序列设计引物,并在引物5'-末端加上需要的酶切位点,扩增hfq向基因上、下游同源性片段,定向连接成hfq基因缺损型同源核苷酸片段,并与自杀质粒pGMB151相连后,克隆至大肠埃希菌中,筛选阳性克隆,并对重组质粒进行测序鉴定,将阳性重质粒经电击法导入伤寒沙门菌野生株,进行同源重组,用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为hfq基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。2.全基因组芯片分析伤寒沙门菌转录表达谱。利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,体外模拟高渗环境应激,在低渗(50 mmol/LNaCl)LB培养液中分别培养伤寒沙门菌野生株和hfq基因缺陷变异株4h(37℃,250 rpm)至对数生长期,然后加入NaCl达到终浓度300 mmol/L(高渗),继续培养30 min后,分别提取野生株和hfq基因缺陷变异株的总RNA,反转录成cDNA并标记荧光(cy3或cy5),与基因组芯片杂交,扫描后根据荧光信号分析各基因转录表达水平,比较伤寒沙门菌野生株和hfq基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达谱差异。3.在伤寒沙门菌hfq缺陷变异株中回补hfq基因。根据伤寒沙门菌hfq基因序列设计引物,用PCR扩增含启动子区域hfq基因,并将其与pBAD/gⅢ质粒定向连接,筛选重组质粒并进行测序鉴定,将阳性重组质粒经热击法导入伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株,作为hfq基因回补株,同时用pBAD空质粒导入伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株作为对照株。***-ompR双缺陷菌株变异株制备。将含hfq基因同源缺失片段的阳性重组自杀质粒pGMB151用电击法导入ompR缺陷菌株,进行同源重组,用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为hfq-ompR双缺陷菌株。***-PCR分析基因表达。选择部分芯片分析显示表达差异基因,设计并合成特异性引物,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR),验证芯片分析结果;设计tviA基因特异性引物,qRT-PCR分析伤寒沙门菌野生型菌株、hfq基因缺陷变异菌株和hfq基因回补菌株分别在持续低渗、持续高渗和高渗应激环境中tviA的表达,以探查不同环境下hfq对tviA的调节作用;并进一步分析伤寒沙门菌野生型菌株、hfq基因缺陷变异菌株、ompR基因缺陷变异菌株和hfq-ompR双缺陷菌株在高渗应激下的tviA表达的变化,察看Hfq和OmpR对tviA的调节是否存在联系。结果:***及序列分析证实,hfq基因缺陷变异株中hfq基因缺失了132bp,表明成功构建hfq基因缺陷变异株。2.基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株在高渗应激早期有62个基因表达上调,有32个基因表达下调。这些基因主要涉及侵袭蛋白、外膜蛋白、代谢酶类和一些未知功能的推测蛋白。部分差异表达基因经qRT-PCR验证,结果显示与基因芯片表达谱分析结果一致。***及序列分析证实hfq基因回补菌株及hfq-ompR双缺陷菌株制备成功。4.在高渗应激下hfq基因缺陷变异株中tviA表达上调,hfq基因回补菌株tviA表达与野生株接近,而在持续低渗和高渗条件下野生株和hfq基因缺陷变异株中tviA的表达水平相似。在高渗应激下hfq-ompR双缺陷菌株中的tviA的表达水平与hfq基因缺陷变异株中的基本一致。结论:Hfq在伤寒沙门菌高渗应激条件下对基因表达调节及侵袭力的提高等发挥重要作用;伤寒沙门菌在高渗应激后Hfq能抑制tviA基因的表达,而在稳态高渗下没有作用;伤寒沙门菌Hfq在高渗应激下对tviA的调节与OmpR无直接相关。

关键词：伤寒沙门菌 hfq tviA 基因芯片高渗应激

PmrA对伤寒沙门菌高渗应激后期基因表达调节作用

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PmrA对伤寒沙门菌高渗应激后期基因表达调节作用

作者：高宇琳江苏大学

学位级别：硕士

目的PmrA为伤寒沙门菌双组份调节系统的效应调节蛋白,在高渗应激的后期其基因表达明显下调。本研究的目的是进一步探讨伤寒沙门菌调节因子PmrA在高渗应激后期对基因表达调节的影响。方法(1)伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株制备:采用自杀质... 详细信息

目的PmrA为伤寒沙门菌双组份调节系统的效应调节蛋白,在高渗应激的后期其基因表达明显下调。本研究的目的是进一步探讨伤寒沙门菌调节因子PmrA在高渗应激后期对基因表达调节的影响。方法(1)伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株制备:采用自杀质粒pGMB151介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌调节因子PmrA的基因缺陷变异株,根据伤寒沙门菌pmrA基因序列设计引物,扩增pmrA基因上、下游同源性片段,定向连接成pmrA基因缺损型同源核苷酸片段,并与自杀质粒pGMB151相连后经电击法导入伤寒沙门菌野生株,在5%蔗糖LB平板上进行同源重组,通过筛选获得pmrA基因缺陷变异株;(2)伤寒沙门菌基因转录表达谱分析:利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,体外模拟高渗环境应激,在低渗(50 mmol/L NaCl)LB培养液中分别培养伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株4h(37℃,250r/min)至对数生长期,后转入高渗(300 mmol/L NaCl)LB培养液中在同样条件下继续培养,在高渗应激后期(120min),分别提取伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株的总RNA,反转录成cDNA并标记荧光(cy3或cy5),与基因组芯片杂交,扫描后据荧光信号分析各基因转录表达水平,比较伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期的基因表达谱差异;(3)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析:选择部分表达差异显著的基因,设计并合成特异性引物,进行实时荧光定量PCR,验证DNA芯片分析结果。,结果(1)PCR及序列分析证实,pmrA基因缺陷变异株中pmrA基因351bp被6bp取代,表明成功构建pmrA基因缺陷变异株;(2)基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期有81个基因表达上调,有22个基因表达下调。其主要涉及ABC转运系统相关蛋白、鞭毛蛋白、侵袭蛋白、外膜蛋白及一些酶类等;(3)对pmrA基因缺陷变异株中表达差异基因(yliC,putA),利用实时荧光定量PCR进行分析其mRNA水平,结果显示其在pmrA基因缺陷变异株和野生株中差异与基因芯片分析结果基本一致。结论成功构建伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株;PmrA在伤寒沙门菌高渗应激后期,对基因表达调节与物质转运及侵袭力的提高等发挥重要作用。

关键词：伤寒沙门菌 PmrA 基因芯片高渗应激侵袭

UhpA对伤寒沙门菌高渗应激的基因表达调节作用

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UhpA对伤寒沙门菌高渗应激的基因表达调节作用

作者：李君辉江苏大学

学位级别：硕士

目的UhpA为伤寒沙门菌双组份调节系统的效应调节蛋白,在高渗应激下其基因表达明显上调。本研究的目的是进一步探讨伤寒沙门菌调节因子UhpA在高渗应激下对基因表达调节的影响。方法(1)伤寒沙门菌uhpA基因缺陷变异株制备:采用自杀质粒pGMB... 详细信息

目的UhpA为伤寒沙门菌双组份调节系统的效应调节蛋白,在高渗应激下其基因表达明显上调。本研究的目的是进一步探讨伤寒沙门菌调节因子UhpA在高渗应激下对基因表达调节的影响。方法(1)伤寒沙门菌uhpA基因缺陷变异株制备:采用自杀质粒pGMB151介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌调节因子UhpA的基因缺陷变异株,根据伤寒沙门菌uhpA基因序列设计引物,扩增uhpA基因上、下游同源性片段,定向连接成uhpA基因缺损型同源核苷酸片段,并与自杀质粒pGMB151相连后经电击法导入伤寒沙门菌野生株,在5%蔗糖LB平板上进行同源重组,通过筛选获得uhpA基因缺陷变异株。(2)伤寒沙门菌基因转录表达谱分析:利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,体外模拟高渗环境应激,在低渗(50 mM NaCl)LB培养液中分别培养伤寒沙门菌野生株和uhpA基因缺陷变异株4h(37℃,250r/min)至对数生长期,后转入高渗(300 mM NaCl)LB培养液中在同样条件下继续培养,在高渗应激30 min后,分别提取伤寒沙门菌野生株和uhpA基因缺陷变异株的总RNA,反转录成cDNA并标记荧光(cy3或cy5),与基因组芯片杂交,扫描后据荧光信号分析各基因转录表达水平,比较伤寒沙门菌野生株和uhpA基因缺陷变异株在高渗应激下的基因表达谱差异。(3)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析:选择部分表达差异显著的基因,设计并合成特异性引物,进行实时荧光定量PCR,验证DNA芯片分析结果。(4)UhpA蛋白表达纯化:根据伤寒沙门菌uhpA基因序列设计引物,扩增uhpA基因片段,与表达载体pET-22b连接经热击法转化入大肠杆菌JM109,用IPTG诱导表达UhpA蛋白,用镍柱按产品说明纯化UhpA蛋白。(5)凝胶阻滞试验:根据伤寒沙门菌cysD基因以及treB基因序列设计引物,设计特异性引物扩增出cysD基因以及treB基因启动子区域。取1-2ug PCR产物与不同浓度的UhpA蛋白混合,加入相应体积的GSM缓冲液,使三者反应总体积为20 ul,30℃孵育15 min。选取198 bp的真核生物PCR产物作为阴性对照,8%的丙烯酰胺胶电泳分离条带,溴化乙锭染色。结果(1)PCR及序列分析证实,uhpA基因缺陷变异株中uhpA基因297bp被6 bp取代,表明成功构建uhpA基因缺陷变异株。(2)基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌uhpA基因缺陷变异株在高渗应激下有21个基因表达下调。绝大多数下调基因与硫代谢相关。(3)对uhpA基因缺陷变异株中表达差异基因(cysM,treB),利用实时荧光定量PCR进行分析其mRNA水平,其结果与基因芯片分析结果基本一致。(4)成功表达并纯化出UhpA蛋白,用于凝胶阻滞试验。(5)选取uhpA基因缺陷变异株中表达差异基因(cysD,treB),凝胶阻滞试验的结果表明UhpA对treB,cysD等基因无直接调控作用。结论成功构建伤寒沙门菌uhpA基因缺陷变异株;UhpA在伤寒沙门菌高渗应激下对硫代谢基因表达调节发挥重要作用。

关键词：伤寒沙门菌 UhPA 基因芯片高渗应激凝胶阻滞

P38丝裂原激活蛋白激酶信号通路参与高渗应激诱导黏蛋白5AC高表达研究

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P38丝裂原激活蛋白激酶信号通路参与高渗应激诱导黏蛋白5AC高表达...

作者：李文锋重庆医科大学

学位级别：硕士

目的探讨p38丝裂原激活蛋白激酶(P38)信号通路参与高渗应激诱导黏蛋白5AC(MUC5AC)高表达的作用机制。方法利用545、695、855、1 055和1 280 mOsm/L高渗氯化钠溶液培养人气道上皮NCl-H292细胞。同时以1 280 mOsm/L高渗氯化钠为刺激因素,... 详细信息

目的探讨p38丝裂原激活蛋白激酶(P38)信号通路参与高渗应激诱导黏蛋白5AC(MUC5AC)高表达的作用机制。方法利用545、695、855、1 055和1 280 mOsm/L高渗氯化钠溶液培养人气道上皮NCl-H292细胞。同时以1 280 mOsm/L高渗氯化钠为刺激因素,以P38特异性抑制剂SB203580、c-jun氨基末端激酶(JNK)特异性抑制剂SP600125及细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)特异性抑制剂U0126为干预因素。采用RT-PCR技术及ELISA观察培养细胞MUC5AC转录水平和MUC5AC蛋白水平改变。采用Western blotting法检测1 280 mOsm/L高渗氯化钠培养上清液中细胞匀浆磷酸化P38(p-P38)、磷酸化JNK(p-JNK)及磷酸化ERK(p-ERK)蛋白水平。结果分别以545、695、855、1 055和1 280 mOsm/L高渗氯化钠刺激后,培养细胞中MUC5ACmRNA及蛋白含量显著高于对照组(P高渗氯化钠所致的p-P38含量升高,同时显著下调MUC5ACmRNA及蛋白含量(P高渗氯化钠对ERK的含量无影响(P﹥0.05),相应的U0126对MUC5ACmRNA转录及蛋白含量也无明显影响(P﹥0.05)。结论高渗应激可呈浓度依赖性地从转录水平诱导气道上皮细胞呈现黏液高分泌状态,且P38信号通路起主要作用。

关键词：酶联免疫吸附测定高渗应激 P38丝裂原激活蛋白激酶黏蛋白5AC

PmrA对伤寒沙门菌高渗应激后期基因表达调节初探

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江苏大学学报（医学版） 2009年第2期19卷 146-151页

作者：高宇琳张海方邹昕杜鸿夏秋风生秀梅徐顺高黄新祥江苏大学基础医学与医学技术学院生物化学研究室江苏镇江212013

目的:探讨伤寒沙门菌调节因子PmrA在高渗应激后期对基因表达调节的影响。方法:应用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株;利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,比较伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株在高渗... 详细信息

目的:探讨伤寒沙门菌调节因子PmrA在高渗应激后期对基因表达调节的影响。方法:应用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株;利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,比较伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期的基因表达谱差异,并选择部分差异表达基因进行RT-RCR验证。结果:经PCR及序列分析证实,伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株制备成功;基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期有81个基因表达上调,有22个基因表达下调。结论:PmrA在伤寒沙门菌高渗应激后期的基因表达调节中发挥重要作用。

关键词：伤寒沙门菌 PmrA 高渗应激基因芯片

mig-14对伤寒沙门菌在高渗应激早期基因表达的调节

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江苏大学学报（医学版） 2009年第3期19卷 192-196页

作者：夏秋风邹昕杜鸿高宇琳黄新祥江苏大学基础医学与医学技术学院生物化学系江苏镇江212013

目的:探查伤寒沙门菌mig-14在高渗应激下对若干基因表达的调节作用。方法:用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌mig-14基因缺陷变异株,用基因芯片分析高渗应激早期野生株和mig-14缺陷株基因表达差异,并对部分结果采用实时荧光定... 详细信息

目的:探查伤寒沙门菌mig-14在高渗应激下对若干基因表达的调节作用。方法:用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌mig-14基因缺陷变异株,用基因芯片分析高渗应激早期野生株和mig-14缺陷株基因表达差异,并对部分结果采用实时荧光定量PCR进行验证。结果:成功制备伤寒沙门菌mig-14缺陷株,高渗应激早期mig-14变异株与野生株相比有77个基因表达下调和72个基因表达上调。结论:mig-14可能是一种调节基因,主要参与调节细菌的物质和能量代谢。

关键词：伤寒沙门菌 mig-14 高渗应激基因芯片分析

OsmY缺失对伤寒沙门菌在高渗应激早期基因表达的影响

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江苏大学学报（医学版） 2012年第4期22卷 286-290,294页

作者：孟彦辰王菲杜鸿翁晓琴张海方生秀梅徐顺高黄新祥江苏大学基础医学与医学技术学院江苏镇江212013 苏州大学附属第二医院检验科江苏苏州215004

目的:研究伤寒沙门菌OsmY在高渗应激早期对其他基因表达的调节。方法:通过同源重组的方法利用自杀质粒制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;采用伤寒沙门菌全基因组芯片比较野生株和osmY基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达差异,并对... 详细信息

目的:研究伤寒沙门菌OsmY在高渗应激早期对其他基因表达的调节。方法:通过同源重组的方法利用自杀质粒制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;采用伤寒沙门菌全基因组芯片比较野生株和osmY基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达差异,并对其中部分表达差异基因进行实时定量PCR验证。结果:成功制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;基因芯片结果显示,在高渗应激早期,与野生株相比,伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株有128个基因表达下调,有27个基因表达上调。实时定量PCR与芯片结果一致。结论:OsmY可作为一调节因子在伤寒沙门菌高渗应激早期对基因表达起重要调节作用。

关键词：伤寒沙门菌 OsmY 高渗应激基因芯片