PmrA对伤寒沙门菌高渗应激后期基因表达调节作用

作     者：高宇琳 

作者单位：江苏大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄新祥

授予年度：2009年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：伤寒沙门菌 PmrA 基因芯片 高渗应激 侵袭 

摘      要：目的 PmrA为伤寒沙门菌双组份调节系统的效应调节蛋白,在高渗应激的后期其基因表达明显下调。本研究的目的是进一步探讨伤寒沙门菌调节因子PmrA在高渗应激后期对基因表达调节的影响。 方法 (1)伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株制备:采用自杀质粒pGMB151介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌调节因子PmrA的基因缺陷变异株,根据伤寒沙门菌pmrA基因序列设计引物,扩增pmrA基因上、下游同源性片段,定向连接成pmrA基因缺损型同源核苷酸片段,并与自杀质粒pGMB151相连后经电击法导入伤寒沙门菌野生株,在5%蔗糖LB平板上进行同源重组,通过筛选获得pmrA基因缺陷变异株;(2)伤寒沙门菌基因转录表达谱分析:利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,体外模拟高渗环境应激,在低渗(50 mmol/L NaCl)LB培养液中分别培养伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株4h(37℃,250r/min)至对数生长期,后转入高渗(300 mmol/L NaCl)LB培养液中在同样条件下继续培养,在高渗应激后期(120min),分别提取伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株的总RNA,反转录成cDNA并标记荧光(cy3或cy5),与基因组芯片杂交,扫描后据荧光信号分析各基因转录表达水平,比较伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期的基因表达谱差异;(3)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析:选择部分表达差异显著的基因,设计并合成特异性引物,进行实时荧光定量PCR,验证DNA芯片分析结果。, 结果 (1)PCR及序列分析证实,pmrA基因缺陷变异株中pmrA基因351bp被6bp取代,表明成功构建pmrA基因缺陷变异株;(2)基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期有81个基因表达上调,有22个基因表达下调。其主要涉及ABC转运系统相关蛋白、鞭毛蛋白、侵袭蛋白、外膜蛋白及一些酶类等;(3)对pmrA基因缺陷变异株中表达差异基因(yliC,putA),利用实时荧光定量PCR进行分析其mRNA水平,结果显示其在pmrA基因缺陷变异株和野生株中差异与基因芯片分析结果基本一致。 结论 成功构建伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株;PmrA在伤寒沙门菌高渗应激后期,对基因表达调节与物质转运及侵袭力的提高等发挥重要作用。