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云南烟草产区辣椒脉斑驳病毒的调查及其遗传多样性分析

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植物保护 2024年第2期50卷 192-201,218页

作者：陈越韩天华马文广钟静尹跃艳赵丽玲李婷婷丁铭云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所云南省农业生物技术重点实验室农业农村部西南农业基因资源与种质创制重点实验室昆明650205 云南省农业科学院高山经济植物研究所丽江674100 云南省烟草公司丽江市公司丽江674100

明确辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus,ChiVMV)在云南6个州(市)烟草生产区的分布、遗传多样性和群体遗传结构,对病害的防控预警具有重要意义。本研究以2022年采集自云南6个州(市)不同烟草产区的96份疑似感染ChiVMV的烟草样品... 详细信息

明确辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus,ChiVMV)在云南6个州(市)烟草生产区的分布、遗传多样性和群体遗传结构,对病害的防控预警具有重要意义。本研究以2022年采集自云南6个州(市)不同烟草产区的96份疑似感染ChiVMV的烟草样品为试验材料,利用电子显微镜负染色观察和分子生物学方法对病毒进行检测和鉴定,获得21个ChiVMV云南烟草分离物的cp基因序列。利用SDT、MEGA、RDP、DnaSP及Arlequin等生物学软件对21个云南烟草分离物及NCBI上下载的38个来自不同国家、地区及寄主的ChiVMV分离物cp基因序列的系统进化、遗传多样性和群体遗传结构特征进行分析。结果显示,从云南6个州(市)烟草生产区采集的96份烟草样品中,ChiVMV检出率为51.04%;序列比对发现,本研究获得的cp基因与NCBI中38个ChiVMV分离物cp基因的核苷酸一致性在84.1%以上;系统发育分析发现,59个ChiVMV分离物按照地理位置的远近被划分为4个分支,聚类结果具有明显的地理分布特征,而与寄主植物无关;遗传多样性和遗传分化分析表明,4个地理种群的ChiVMV cp基因遗传多样性水平均较高,中国种群与印度、泰国和其他国家种群间发生了很大的遗传分化且差异显著(P<0.05);遗传力分析显示,基因交流、遗传漂变和基因的负选择压力是ChiVMV分离物适应性进化的重要方式。

关键词：辣椒脉斑驳病毒云南遗传多样性遗传结构 cp基因

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辣椒脉斑驳病毒病研究进展

园艺学报 2020年第9期47卷 1741-1751页

作者：龚明霞王萌赵虎吴星赵曾菁何志黄金梅王日升广西农业科学院蔬菜研究所南宁530007 广西蔬菜育种与新技术研究重点实验室南宁530007

辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus,ChiVMV)于1979年在马来半岛的辣椒上被首次报道,现已蔓延至世界各地。在中国,ChiVMV自2003年在陕西出现以来,已在四川、湖南、贵州等辣椒主产区大面积发生,成为严重危害辣椒生产的主要病害... 详细信息

辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus,ChiVMV)于1979年在马来半岛的辣椒上被首次报道,现已蔓延至世界各地。在中国,ChiVMV自2003年在陕西出现以来,已在四川、湖南、贵州等辣椒主产区大面积发生,成为严重危害辣椒生产的主要病害之一。本文中重点对ChiVMV危害症状、传播以及株系分化、基因组结构及功能、辣椒抗性鉴定、遗传以及分子标记定位等方面研究进行综述,以期为抗病育种工作提供理论参考。

关键词：辣椒辣椒脉斑驳病毒抗病育种

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辣椒脉斑驳病毒的多基因联合检测与鉴定

中国农业科学 2020年第16期53卷 3412-3420页

作者：杨宏凯杨晶文沈建国蔡伟高芳銮福建农林大学植物病毒研究所福建省植物病毒学重点实验室福州海关技术中心榕城海关综合技术服务中心

【目的】辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是辣椒生产上危害严重的病毒,也是口岸检疫的重要病毒之一。本文旨在建立一种快速检测ChiVMV的多基因联合检测方法,实现ChiVMV的快速、准确鉴定。【方法】利用DAS-ELISA、RT-... 详细信息

【目的】辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是辣椒生产上危害严重的病毒,也是口岸检疫的重要病毒之一。本文旨在建立一种快速检测ChiVMV的多基因联合检测方法,实现ChiVMV的快速、准确鉴定。【方法】利用DAS-ELISA、RT-PCR方法对印度进境辣椒进行检测以确定是否携带有ChiVMV。根据ChiVMV外壳蛋白(coat protein,CP)和圆柱状内含体蛋白(cytoplasmic inclusion protein,CI)保守区域分别设计引物,筛选两个基因(CP和CI)的特异性引物组合,通过设定不同的引物用量组合以及对退火温度等条件进行优化,探索最佳的反应条件,建立多基因联合检测方法。利用建立的多基因联合检测体系对包含ChiVMV在内的辣椒病毒进行检测,以验证该体系特异性。同时对ChiVMV阳性样品的不同浓度cDNA进行扩增,测定其检测灵敏度。此外,对田间辣椒样本进行检测,以验证体系的实际应用效果。【结果】通过对印度进境辣椒的DAS-ELISA检测,发现样品提取液与ChiVMV呈阳性反应;利用CP861-F/CP861-R特异性引物对进行RT-PCR,扩增出与预期大小相一致的特异性片段,确认该批辣椒样品携带有ChiVMV。多基因联合检测体系中,应用引物对CP337-F/CP337-R、CI655-F/CI655-R分别扩增出长度为337、655 bp的特异性目的片段。经优化后的反应体系和程序为cDNA 2μL、CP337-F/CP337-R各0.625μL(10μmol·L)、CI655-F/CI655-R各1.375μL(10μmol·L)、2×PCR Master Mix12.5μL、ddH2O 6.5μL,退火温度50℃,共35个循环。建立的多基因联合检测方法具有良好的特异性和灵敏度,两个基因检测灵敏度均为10-4数量级。实际应用检测结果表明,该方法可从感染ChiVMV的样品中同时扩增出CP和CI的特异性目的片段。【结论】建立的多基因联合检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点,可为辣椒脉斑驳病毒的快速检测提供可靠的技术支持。

关键词：辣椒脉斑驳病毒外壳蛋白基因圆柱状内含体蛋白基因多基因联合检测

辣椒脉斑驳病毒CP基因的原核表达及其抗血清的制备

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园艺学报 2010年第10期37卷 1598-1604页

作者：吴育鹏王健华冯团诚张雨良王小明刘志昕中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室海口571101 海南大学环境与植物保护学院海南儋州570228

采用RT-PCR方法克隆了辣椒脉斑驳病毒文昌分离物(ChiVMV-WC)的CP基因,并将其连接到原核表达载体pET-30b(+)上,克隆测序以确定其阅读编码框的正确性,然后将获得的重组质粒pET30b-ChiVMVCP转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后,用IPTG进行诱导表达... 详细信息

采用RT-PCR方法克隆了辣椒脉斑驳病毒文昌分离物(ChiVMV-WC)的CP基因,并将其连接到原核表达载体pET-30b(+)上,克隆测序以确定其阅读编码框的正确性,然后将获得的重组质粒pET30b-ChiVMVCP转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,获得的融合蛋白分子量约为38kD。用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化的融合蛋白免疫兔子并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的ChiVMV-WC编码CP蛋白发生特异性反应。间接酶联免疫吸附法(ID-ELISA)检测抗血清效价为1/106。通过对田间20个样品的ID-ELISA检测,证实了所制备的抗血清与ChiVMV病叶具有良好的反应特异性。

关键词：辣椒辣椒脉斑驳病毒外壳蛋白原核表达抗血清

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辣椒脉斑驳病毒侵染性克隆构建的简易方法

四川大学学报（自然科学版） 2015年第5期52卷 1151-1156页

作者：刘健赵霏霏陈应娟吴阳晨朱桐席德慧林宏辉四川大学生命科学学院成都610064

本文介绍了一种构建辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)侵染性克隆的简易方法.基于辣椒脉斑驳病毒的全长确定序列,根据基因内部的单一限制性酶切位点,设计引物,将ChiVMV分成KL1,KL2,KL3三个片段通过RT-PCR和TA克隆的方... 详细信息

本文介绍了一种构建辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)侵染性克隆的简易方法.基于辣椒脉斑驳病毒的全长确定序列,根据基因内部的单一限制性酶切位点,设计引物,将ChiVMV分成KL1,KL2,KL3三个片段通过RT-PCR和TA克隆的方法将3个片段构建到PMD19-T载体上.通过双酶切将ChiVMV前面7000bp的片段构建到载体上,从而将全部的ChiVMV cDNA分段构建到两个重组质粒中,成功地避免了全长病毒序列在大肠杆菌中不稳定的现象.进行体外转录时,先通过PCR扩增出两个彼此有一定重叠的平末端片段,再利用两个重叠片段为模板用重叠PCR的方法扩增出全长带T7启动子的ChiVMV cDNA,并通过T7RNA聚合酶成功转录出ChiVMV的病毒RNA.

关键词：辣椒脉斑驳病毒侵染性克隆体外转录重叠PCR

辣椒脉斑驳病毒对烟草活性氧代谢和光合特性的影响

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四川大学学报（自然科学版） 2014年第1期51卷 183-188页

作者：张萍刘健朱峰陈应娟张静唐荷林宏辉席德慧四川大学生命科学学院成都610064

以普通烟为材料,研究了感染辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)后烟草叶片的生理活性以及光合特性的变化.结果表明ChiVMV侵染后宿主体内活性氧(超氧离子和H2O2)大量积累,而在... 详细信息

以普通烟为材料,研究了感染辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)后烟草叶片的生理活性以及光合特性的变化.结果表明ChiVMV侵染后宿主体内活性氧(超氧离子和H2O2)大量积累,而在CMV感染的植株中产生的活性氧较少.伴随活性氧的增加相关抗氧化物酶(SOD,CAT,POD)的活性也有升高.进一步测定叶绿素荧光参数发现,感病后烟草叶片的Fv/Fm、qP以及ETR等值明显降低,qN、NPQ值升高,并且ChiVMV对宿主光合参数的影响明显强于CMV.通过比较ChiVMV和CMV引起症状的差异性,发现ChiVMV的侵染使得植物产生大量的活性氧,造成了叶绿体结构的氧化性损伤,植物光合速率降低、叶绿体内淀粉粒积累减少,进而造成光合生物量的减少,植物生长受阻,导致感病植株的死亡.

关键词：辣椒脉斑驳病毒黄瓜花叶病毒活性氧抗氧化酶叶绿素荧光

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辣椒脉斑驳病毒文昌分离物基因组测序及分析

基因组学与应用生物学 2011年第5期30卷 583-589页

作者：龚殿王健华吴育鹏张雨良王洪星孙玉娟刘志昕海南大学环境与植物保护学院海口570228 中国热带农业科学院热带生物技术研究所海口571101

辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)近年来严重危害海南黄灯笼辣椒的产量,开展针对该病毒的研究以求达到对其有效防控迫在眉睫。本研究分7段克隆了ChiVMV文昌分离物(ChiVMV Wenchang isolate,ChiVMV-WC)的基因组。分段... 详细信息

辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)近年来严重危害海南黄灯笼辣椒的产量,开展针对该病毒的研究以求达到对其有效防控迫在眉睫。本研究分7段克隆了ChiVMV文昌分离物(ChiVMV Wenchang isolate,ChiVMV-WC)的基因组。分段克隆的测序结果通过拼接,共获得ChiVMV-WC基因组9717个核苷酸(nt)序列(GenBank登录号:GQ981316)。在核苷酸序列的第164位～第9270位存在一个大的开放阅读框(ORF),编码一个多聚蛋白(分子量为350.44kD)。近年来被证实的马铃薯Y病毒科的一个新的ORF(pretty interesting potyviridae ORF,PIPO)存在于ChiVMV-WC基因组核苷酸序列的第2892位～第3110位,编码一个由72个氨基酸聚合而成的多肽(分子量为8.26kD)。ChiVMV-WC与ChiVMV其它分离物的基因组核苷酸序列比较发现该病毒存在着较高的变异率。本研究通过与同属内病毒的同源性分析以及系统进化树分析,确定了ChiVMV-WC在生物进化史上的地位。

关键词：辣椒脉斑驳病毒马铃薯Y病毒属基因组系统进化树黄灯笼

辣椒脉斑驳病毒文昌分离物全基因组序列分析和抗血清的制备

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辣椒脉斑驳病毒文昌分离物全基因组序列分析和抗血清的制备

作者：吴育鹏海南大学

学位级别：硕士

辣椒是一种重要的茄科类蔬菜作物,因其果实营养丰富,特别是维生素C的含量在蔬菜中居第一位而深受人们喜爱。然而,近年来,辣椒病毒病已成为辣椒生产发展的主要限制因素之一。辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus, ChiVMV)是辣椒... 详细信息

辣椒是一种重要的茄科类蔬菜作物,因其果实营养丰富,特别是维生素C的含量在蔬菜中居第一位而深受人们喜爱。然而,近年来,辣椒病毒病已成为辣椒生产发展的主要限制因素之一。辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus, ChiVMV)是辣椒上主要的病毒病害之一,它的存在严重制约着世界各地的辣椒生产,特别是韩国、马来西亚、泰国、印度等国和台湾等地区,辣椒的种植面积与产量均明显下降。辣椒脉斑驳病毒是一种(+)ssRNA病毒,为马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。尽管国内外对Potyvirus属的许多成员的基因组结构和基因产物功能、以及病毒的株系分化和遗传变异有了较深入的研究,但相比较而言,对于ChiVMV的这些方面的研究尚显不够。目前ChiVMV全基因组进行克隆分析的报道不多,仅见报道的有印度与韩国两个分离物,国内还没有相关报道。对其基因功能的研究也大都是与同属其它成员进行比对后推导得出的,而用分子生物学方法研究ChiVMV株系分化和遗传变异的报道更为鲜见。本文以文昌地区染病黄灯笼辣椒叶片的总RNA为模板,通过RT-PCR技术克隆了ChiVMV-WC分离物的全基因组序列,利用多种生物学软件对该病毒的基因组全序列结构特征进行了分析和预测,并确定它的分类地位;作者在ChiVMV-WC分离物的全基因组序列分析的基础上对编码基因CP进行原核表达及制备特异性抗血清,为ChiVMV的检测体系的建立打下基础。本文获得的主要结论如下： 1.成功克隆了ChiVMV-WC分离物全基因组序列,基因组全长为9717 nt,包含一个长9270 nt的单一开放阅读框(ORF),编码一个350.44 kDa的多聚蛋白。与其它马铃薯Y属病毒一样,多聚蛋白内有9个推定的保守酶切位点,切割产生10个成熟蛋白。 2. ChiVMV-WC与报道的印度与韩国分离物(AJ237843和AJ972878)全基因组序列同源性分别为85.66%和93.54%,编码多聚蛋白氨基酸序列同源性分别为89.84%和94.17%。通过与马铃薯Y病毒属其他成员的多聚蛋白氨基酸序列比对,我们确定ChiVMV-WC分离物为Potyvirus属成员。CP和3’-UTR序列的相似性被认为是Y属病毒最重要的分类依据,通过CP氨基酸和3’-UTR序列的比对,我们认为与ChiVMV-VN/C7越南分离物的亲缘关系最近。 3.根据所测的ChiVMV序列设计一对引物,PCR扩增出ChiVMV-WC分离物的CP基因,将其插入到pET-30b(+)载体中,然后将获得的重组质粒pET30b-ChiVMV CP转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE分析,结果显示CP基因高效表达,主要以蛋白可溶性形式稳定表达。通过对诱导条件的优化,确立了CP基因的表达条件：IPTG终浓度为0.1 mmol／L,诱导时间为2 h。 4.用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化的融合蛋白免疫兔子并获得抗血清。通过酶联法(ID-ELISA)测定本实验制备的ChiVMV抗血清效价为1／106,Western blot检测结果表明,抗血清与ChiVMV-WC诱导表达的CP蛋白发生特异性反应,对田间20个样品进行检测,表明该抗血清的效价高、灵敏度高、特异性强,可以应用于田间样品的检测。

关键词：辣椒脉斑驳病毒序列分析原核表达抗血清制备

辣椒脉斑驳病毒湖南分离物全基因组序列测定及分子特征

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福建农业学报 2020年第2期35卷 187-191页

作者：谭汝晴罗香文卜姗张宇张松柏张德咏刘勇湖南农业大学植物保护学院湖南长沙410120 湖南省植物保护研究所湖南长沙410125

【目的】辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是东南亚茄科作物主产地主要病毒种类之一,严重危害辣椒等茄科作物的生产。测定ChiVMV的全基因组序列,分析其分子特征,可以明确该病毒的适应性进化以及对我国辣椒等茄科作物... 详细信息

【目的】辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是东南亚茄科作物主产地主要病毒种类之一,严重危害辣椒等茄科作物的生产。测定ChiVMV的全基因组序列,分析其分子特征,可以明确该病毒的适应性进化以及对我国辣椒等茄科作物的潜在威胁提供科学基础。【方法】以湖南疑似感染ChiVMV辣椒为样本,采用small RNA高通量测序结合RT-PCR测定病毒全基因组序列,利用Mega、RDP及DnaSP等生物学软件分析其分子特征。【结果】ChiVMV湖南分离物全长基因组序列为9704 nt(不包含3′-A尾),与其他分离物的序列同源性为84%~94%。系统发育分析表明,我国的ChiVMV聚类为一个亚簇,与其他国家和地区分离物不存在重组事件。基因的替换指数R=3.29,替换碱基类型主要是C/T替换。【结论】碱基替换突变可能是ChiVMV湖南分离物适应性进化的主要因素。

关键词：辣椒脉斑驳病毒全基因组序列系统发育分析 RNA突变和重组