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赤羽病病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国动物检疫 2024年第9期41卷 111-117页

作者：李超王素春隋金钰潘俊慧魏世萌祁倩周凯钰太王楷宬中国动物卫生与流行病学中心农业农村部动物生物安全风险预警及防控重点实验室(南方)青岛市动物生物安全重点实验室山东青岛266032

为建立一种快速、灵敏的赤羽病病毒(Akabanediseasevirus,AKAV)核酸检测方法,以AKAV S基因为靶基因,设计特异性引物和Taq Man探针,通过优化反应体系和条件,建立了AKAV荧光定量RT-PCR检测方法,随后开展了敏感性、特异性及重复性评估,并... 详细信息

为建立一种快速、灵敏的赤羽病病毒(Akabanediseasevirus,AKAV)核酸检测方法,以AKAV S基因为靶基因,设计特异性引物和Taq Man探针,通过优化反应体系和条件,建立了AKAV荧光定量RT-PCR检测方法,随后开展了敏感性、特异性及重复性评估,并利用该方法与AKAV检疫行业标准推荐方法同时对临床采集的80份牛羊血液样品进行检测,以检验方法的临床应用效果。结果显示:本研究建立的检测方法敏感性较高,最低检测限为13.4 copies/μL;特异性良好,与口蹄疫病毒、牛冠状病毒、牛结节性皮肤病病毒、牛病毒性腹泻病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒、牛白血病病毒等均无交叉反应;组内试验变异系数为0.93%~2.47%,组间试验为1.25%~2.76%,重复性良好;利用建立的方法从80份临床样品中检出AKAV阳性样品21份,该检测结果与AKAV检疫行业标准推荐方法的符合率为98.75%。结果表明,本研究建立的AKAV荧光定量RT-PCR检测方法敏感性高,特异性及重复性好,适用于赤羽病临床检测,为赤羽病病原学监测和诊断技术标准开发提供了技术支撑。

关键词：赤羽病病毒实时荧光定量RT-PCR 方法建立初步应用

赤羽病病毒核衣壳蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

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中国兽医科学 2006年第11期36卷 868-875页

作者：徐树兰李少英辛九庆尹训南孟庆文吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黑龙江哈尔滨150001

以纯化的重组赤羽病病毒核衣壳蛋白作为诊断抗原,建立了检测牛血清特异性核衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法,初步组装成便于现地使用的试剂盒。经对试验条件进行优化,确定最佳抗原包被量为每孔1μg(100μL),样品稀释度为1∶100,兔抗牛IgG... 详细信息

以纯化的重组赤羽病病毒核衣壳蛋白作为诊断抗原,建立了检测牛血清特异性核衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法,初步组装成便于现地使用的试剂盒。经对试验条件进行优化,确定最佳抗原包被量为每孔1μg(100μL),样品稀释度为1∶100,兔抗牛IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶8 000。经特异性试验和重复性试验证明该方法特异性高、重复性好。应用初步研制的间接ELISA试剂盒和微量中和试验法分别对云南省的89份、内蒙古的100份牛血清样本进行了检测,以中和试验为参照,经统计学处理,得出检测临界值分别为0.411和0.303,2种方法的符合率分别为72.7%(56/77)和91.4%(85/93)。试剂盒在37℃保存3 d,对敏感性无明显影响。

关键词：赤羽病病毒核衣壳蛋白间接ELISA

赤羽病病毒N基因硫氧还蛋白融合表达载体的构建与表达

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中国兽医科技 2003年第10期33卷 7-14页

作者：花群义杨云庆董俊杨晶焰贾建军周晓黎徐自忠云南出入境检验检疫局技术中心云南昆明650228

为获得赤羽病病毒 (Akabanevirus ,AKAV )的核蛋白重组抗原 ,根据其基因序列(SmRNA)设计合成了 1对特异性引物 ,对AKAVN基因进行RT PCR扩增 ,产物大小约为 6 96bp ,回收纯化后 ,将其克隆至 pMD18 T质粒载体中 ,经核苷酸序列分析 ,与已... 详细信息

为获得赤羽病病毒 (Akabanevirus ,AKAV )的核蛋白重组抗原 ,根据其基因序列(SmRNA)设计合成了 1对特异性引物 ,对AKAVN基因进行RT PCR扩增 ,产物大小约为 6 96bp ,回收纯化后 ,将其克隆至 pMD18 T质粒载体中 ,经核苷酸序列分析 ,与已报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白N的SmRNA基因比较后发现 ,所测定毒株的核苷酸序列与TIN毒株的同源性高达 98.3% ,推测的氨基酸同源性为 97.6 % ,证实为AKAV的N基因。将该基因片段亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体 ,转化TOP10细胞 ,成功地构建了AKAVN基因重组表达载体。经L araboinose诱导表达 ,可稳定、高效地表达AKAV核蛋白抗原。表达蛋白为融合蛋白 ,分子质量约 4 2 .5ku ,其表达产量约占菌体总蛋白的 2 8% ,融合蛋白中含有AKAV特异性核蛋白抗原。

关键词：赤羽病病毒 N基因核蛋白基因基因表达 ELISA 基因序列

赤羽病病毒核衣壳蛋白基因的表达纯化及活性鉴定

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中国兽医科技 2005年第12期35卷 937-941页

作者：李少英冉多良孟庆文吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黑龙江哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学院新疆乌鲁木齐830052

为获得赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)核衣壳蛋白重组抗原,经RT-PCR扩增了OBE-1株的S节段,将其插入到pMD 18-T载体,然后用带有酶切位点的引物从该重组载体亚克隆出表达核衣壳蛋白的N基因,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后与同样处理的表达载体p... 详细信息

为获得赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)核衣壳蛋白重组抗原,经RT-PCR扩增了OBE-1株的S节段,将其插入到pMD 18-T载体,然后用带有酶切位点的引物从该重组载体亚克隆出表达核衣壳蛋白的N基因,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后与同样处理的表达载体pET-28a(+)进行连接,转化感受态细胞BL21(DE3)。将筛选出的阳性克隆进行测序、IPTG诱导表达和融合蛋白纯化及活性鉴定。结果表明,N基因含有1个全长702 bp的ORF,编码233个氨基酸,通过SDS-PAGE和Western-blotting分析,证实重组菌株可高效表达有免疫活性的分子质量约27 ku的可溶性融合蛋白,用薄层扫描仪分析,其最高表达量占可溶性菌体蛋白总量的58.5%。工程菌经超声波裂解高速离心后,上清液在ProBondTMPurification System(含Ni2+)天然状态下纯化,可获得高纯度的融合蛋白。

关键词：赤羽病病毒核衣壳蛋白表达纯化

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赤羽病病毒RT-LAMP检测方法的建立

中国预防兽医学报 2013年第10期35卷 829-832页

作者：张吉红潘登黄素文黄绍棠李如松王建峰倪健波宁波出入境检验检疫局浙江宁波315012 浙江万里学院生物环境学院浙江宁波315100

为建立一种赤羽病病毒(AKAV)的快速检测方法,本研究根据环介导等温扩增技术(LAMP)原理,设计了针对AKAV S基因的特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了AKAV的RT-LAMP方法。特异性和灵敏度试验结果显示,所建立的RT-LAMP检测... 详细信息

为建立一种赤羽病病毒(AKAV)的快速检测方法,本研究根据环介导等温扩增技术(LAMP)原理,设计了针对AKAV S基因的特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了AKAV的RT-LAMP方法。特异性和灵敏度试验结果显示,所建立的RT-LAMP检测方法具有良好的特异性,与蓝舌病、牛病毒性腹泻及传染性牛鼻气管炎等病毒无交叉反应,敏感度可达11.5拷贝/μL,采用SYBR Green I染色,肉眼即可判定检测结果。该方法能够简便、快速、灵敏、特异地检测AKAV。

关键词：反转录环介导等温扩增赤羽病病毒检测

赤羽病病毒核衣壳蛋白原核表达及单克隆抗体制备

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中国兽医科学 2021年第11期51卷 1398-1403页

作者：魏方陈冬杰林祥梅吴绍强中国检验检疫科学研究院动物检验与检疫研究所北京100176

为制备赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)核衣壳(N)蛋白单克隆抗体,本研究构建了pET-28aAKAV-N重组质粒,并将其转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达和镍柱纯化获得重组N蛋白。用重组N蛋白4次免疫小鼠后,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞... 详细信息

为制备赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)核衣壳(N)蛋白单克隆抗体,本研究构建了pET-28aAKAV-N重组质粒,并将其转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达和镍柱纯化获得重组N蛋白。用重组N蛋白4次免疫小鼠后,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞,利用亚克隆技术和ELISA方法筛选出4株阳性细胞株,分别命名为2D3、5F10、1F4和5D4,并对其进行特异性分析。免疫印迹(Western-blot)结果显示,2D3仅识别AKAV-N蛋白,5F10、1F4和5D4均能够同时识别AKAV-N和施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)N蛋白;间接免疫荧光(IFA)结果显示,2D3、1F4和5D4与AKAV感染的BHK21细胞呈阳性反应,而5F10为阴性。亚型检测结果显示,2D3抗体为IgG2a/к型,5F10、5D4抗体为IgG1/к型,1F4抗体为IgG1/λ型。综上所述,本研究获得的单克隆抗体能够为AKAV-N蛋白的相关研究提供支持。

关键词：赤羽病病毒 N蛋白原核表达单克隆抗体鉴定

赤羽病病毒G1蛋白生物信息学分析及截短基因的真核表达

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畜牧与兽医 2023年第10期55卷 61-69页

作者：胡世享叶玲玲肖妍卓娜陈朝林汪琳蒲静陈培富艾军云南农业大学云南昆明651000 昆明海关技术中心云南昆明651000 天津海关动植物与食品检测中心天津300041 中国海关科学技术研究中心北京100026

为得到赤羽病病毒(AKV)G1蛋白的截短表达产物作为诊断抗原,通过PCR扩增、酶切、连接、转化等技术手段,成功克隆出优势抗原结合表位区Thr189-Val 397对应的目的基因G1-2。将目的基因克隆至昆虫杆状病毒表达载体pFastBac HTB,将该重组质... 详细信息

为得到赤羽病病毒(AKV)G1蛋白的截短表达产物作为诊断抗原,通过PCR扩增、酶切、连接、转化等技术手段,成功克隆出优势抗原结合表位区Thr189-Val 397对应的目的基因G1-2。将目的基因克隆至昆虫杆状病毒表达载体pFastBac HTB,将该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒Bacmid-AKV-G1-2,用Cellfectin ReagentⅡ介导转染sf9细胞,获得重组蛋白,Western blot法检测和分析重组蛋白表达情况。软件分析结果表明189~397 aa肽段为亲水性蛋白,存在跨膜区,该蛋白存在多个潜在的磷酸化位点,具有丰富的潜在抗原表位,属于优势抗原肽段,选取该肽段进行截短真核表达,以AKV抗体阳性血清进行Western blot鉴定,重组蛋白能被特异性识别,出现预期蛋白反应条带,表明G1-2蛋白成功表达,分子量约为27 kDa。本研究为进一步开展截短表达产物为抗原的赤羽病病毒诊断试剂研制奠定了基础。

关键词：赤羽病病毒 G1蛋白杆状病毒表达生物信息学截短表达

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赤羽病病毒和施马伦贝格病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立和应用

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中国动物传染病学报 2023年

作者：邓俊花陈冬杰魏方王晶晶吕继洲吴绍强中国检验检疫科学研究院

为建立一种能够同时检测赤羽病病毒（AKAV）和施马伦贝格病毒（SBV）的方法，本研究以AKAV和SBV的S基因为靶基因，设计其通用引物和特异性探针，通过优化反应条件，建立了AKAV和SBV双重荧光RT-PCR检测方法，并对其特异性、敏感性及重复... 详细信息

为建立一种能够同时检测赤羽病病毒（AKAV）和施马伦贝格病毒（SBV）的方法，本研究以AKAV和SBV的S基因为靶基因，设计其通用引物和特异性探针，通过优化反应条件，建立了AKAV和SBV双重荧光RT-PCR检测方法，并对其特异性、敏感性及重复性进行检验。同时，评估其临床应用效果。结果显示，该方法AKAV以及SBV最低检测线均可达1.5 copies/μL；与牛病毒性腹泻病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒均无交叉反应，具有良好的特异性；50份临床样品检测结果与AKAV、SBV行业标准推荐方法符合率为100%。本研究建立的双重荧光RT-PCR方法，适用于AKAV和SBV的临床检测，为该病疫情防控提供了新的筛查手段。

关键词：赤羽病病毒施马伦贝格病毒双重荧光RT-PCR 应用

赤羽病病毒套式RT-PCR检测方法的建立与初步应用

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畜牧与兽医 2010年第6期42卷 1-4页

作者：张吉红黄素文闻伟刚李如松宁波出入境检验检疫局浙江宁波315012

根据GenBank中已发表的赤羽病病毒(AKAV)的S基因序列,设计了3条特异性引物,建立了检测AKAV的套式RT-PCR方法。特异性试验表明,该方法可以特异扩增出AKAV的S基因片段,但从牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV)等13种对照... 详细信息

根据GenBank中已发表的赤羽病病毒(AKAV)的S基因序列,设计了3条特异性引物,建立了检测AKAV的套式RT-PCR方法。特异性试验表明,该方法可以特异扩增出AKAV的S基因片段,但从牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV)等13种对照病毒中均不能扩增出目的条带。敏感性试验表明,套式RT-PCR能够扩增10-5稀释度的病毒RNA(核酸含量约1.18 ng/μL),比普通RT-PCR高出1 000倍。用此方法检测130份奶牛血清样品与1份流产胎儿病料,均未检测到阳性样本,但AKAV在血清模拟样品中可被有效检出。研究结果表明,该方法灵敏、特异,为AKAV的检测提供了一个快速、有效的手段。

关键词：赤羽病病毒套式 RT-PCR检测 RT-PCR方法初步应用 detection nested RT-PCR 牛病毒性腹泻病毒牛鼻气管炎病毒特异扩增特异性引物特异性试验敏感性试验血清样品模拟样品流产胎儿基因序列基因片段核酸含量 GenBank