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中华微生物学和免疫学杂志 2005年第9期25卷 773-776页

作者：井申荣邹全明曾韦锟毛旭虎刘开云第三军医大学医学检验系临床微生物及免疫学教研室

目的在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人白细胞介素10(rhIL-10),用于IL-10的生理功能研究和动物试验。方法通过PCR扩增IL-10基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,再将融合基因αIL-10重组... 详细信息

目的在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人白细胞介素10(rhIL-10),用于IL-10的生理功能研究和动物试验。方法通过PCR扩增IL-10基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,再将融合基因αIL-10重组到表达质粒ppic9k的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,SalⅠ酶切线性化重组质粒IL-10/ppic9k,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的基因IL-10,甲醇诱导rhIL-10的表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定目的蛋白,用ELISA定量测定及MC/9细胞分析IL-10生物学活性。结果成功构建了重组表达质粒IL-10/ppic9k,获得了4个含IL-10基因的高拷贝毕赤酵母转化子,甲醇诱导后,在摇瓶水平的IL-10表达量为(0.627±0.09)mg/L,比活性为1.5×105U/mg。结论毕赤酵母分泌表达的IL-10具有良好的生物学活性。

关键词：白细胞介素10 毕赤酵母分泌表达生物学活性重组人白细胞介素10 生物学活性测定毕赤酵母 IL-10基因质粒ppic9k SDS-PAGE rhIL-10 Western EcoRⅠ

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人巨细胞病毒重组基因表达质粒的构建

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第三军医大学学报 2002年第6期24卷 716-718页

作者：郑育声谢琪璇潘善培芦春斌肖銮娟暨南大学生殖免疫研究中心广州510632

目的　用基因工程技术克隆人巨细胞病毒 (Humancytomegalovirus ,HCMV)中抗原性较强的蛋白片段—gp5 2C末端和pp15 0C末端的DNA序列 ,插入ppic9k质粒 ,构建适于酵母表达系统的重组表达质粒。方法　根据人巨细胞病毒糖蛋白gp5 2和磷酸蛋... 详细信息

目的　用基因工程技术克隆人巨细胞病毒 (Humancytomegalovirus ,HCMV)中抗原性较强的蛋白片段—gp5 2C末端和pp15 0C末端的DNA序列 ,插入ppic9k质粒 ,构建适于酵母表达系统的重组表达质粒。方法　根据人巨细胞病毒糖蛋白gp5 2和磷酸蛋白pp15 0C末端的cDNA序列 ,设计出 2对引物。利用PCR的方法 ,以病毒培养液上清为模板 ,进行二轮PCR扩增 ,把两个目的基因串联在一起 ,将所得的DNA片段经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后用T4连接酶与ppic9k质粒进行连接 ,然后导入大肠杆菌DH5α ,筛选出阳性转化子 ,并用PCR和双酶切鉴定阳性重组子。结果　从人巨细胞病毒培养液上清中扩增出目的基因 ,PCR反应和双酶切鉴定结果与预期相符。

关键词：基因表达人巨细胞病毒重组PCR 质粒ppic9k

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毕赤酵母表达皮蝇素A蛋白

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中国兽医学报 2006年第3期26卷 296-299页

作者：孙怡徐梅倩高兴春何国声中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所上海200232

建立了用毕赤酵母表达系统表达皮蝇素A（Hypodermotin A，HA）的技术，并对表达条件进行了优化筛选。将皮蝇素A基因连接到质粒ppic9k上，构建了重组转移质粒ppic9k—HA。重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115后，用组氨酸缺陷培养基和G... 详细信息

建立了用毕赤酵母表达系统表达皮蝇素A（Hypodermotin A，HA）的技术，并对表达条件进行了优化筛选。将皮蝇素A基因连接到质粒ppic9k上，构建了重组转移质粒ppic9k—HA。重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115后，用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选。重组酵母细胞在含0．5％甲醇的培养基中诱导产生目的蛋白，培养3d后收取上清，用阴离子交换层析柱分离纯化。经SDS—PAGE检测，所表达的蛋白相对分子质量约为30000。Western—blotting表明，该蛋白能与兔抗HA血清特异性结合。明胶电泳检测显示，该蛋白具有酶活性。单因素改变表达条件的结果表明，甲醇浓度在0．5％～1％、溶氧量在70％以上、诱导2～3d的情况下表达产量最高，达1500mg／L左右。该研究结果对防治牛皮蝇蛆痛疫苗的深入研究及毕赤酵母在寄生虫领域的应用有一定价值。

关键词：皮蝇素A 毕赤酵母GS115 表达优化质粒ppic9k

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黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶的基因克隆及在毕赤酵母中的表达和活性检测

黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶的基因克隆及在毕赤酵母中的表达和活性...

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作者：林泽飞广东工业大学

学位级别：硕士

黄粉虫（Tenebrio molitor L.）在昆虫分类学上隶属于鞘翅目,拟步行虫科,粉虫甲属。目前有关研究已经证明,黄粉虫体内含有多种重要生物活性物质,包括蛋白质、氨基酸、脂肪、微量元素和维生素等;大量实验也证明,以黄粉虫为原料制成的保... 详细信息

黄粉虫（Tenebrio molitor L.）在昆虫分类学上隶属于鞘翅目,拟步行虫科,粉虫甲属。目前有关研究已经证明,黄粉虫体内含有多种重要生物活性物质,包括蛋白质、氨基酸、脂肪、微量元素和维生素等;大量实验也证明,以黄粉虫为原料制成的保健品具有提高人体免疫力、抗疲劳、降低血脂、抗癌以及促进新陈代谢等功效。目前,国内主要在其生物学特性和人工养殖技术方面有所研究,作为一种高蛋白营养品,对其功能性蛋白的研究较为罕见。国外对该虫已引起广泛关注,已有对其消化酶的有关研究,和少量关于其具有抑菌和溶血栓作用方面的工作,但对黄粉虫胰蛋白酶样酶的提取、功能以及其基因方面的研究尚少,而对该基因的克隆表达的研究还未见报道。本论文的研究是在课题组前期对其纤溶酶基因进行克隆的基础上,进一步探讨黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶（TMTLSP）基因克隆并在毕赤酵母中表达。毕赤酵母是一种甲基营养型酵母,具有高效表达外源蛋白的能力、完善的分泌系统和翻译后加工机制,适于表达真核蛋白。本文采用了PCR技术,以含有TMTLSP cDNA的质粒作为模板,扩增出TMTLSP基因片段;将克隆获得的目的基因插入到毕赤酵母表达载体ppic9k中,经测序无误后,获得重组表达质粒ppic9k-TMTLSP;将重组表达质粒线性化后电击转化到毕赤酵母GS115中,经筛选并PCR验证获得多拷贝整合型酵母工程菌;对工程菌进行发酵,甲醇诱导表达,取样进行SDS-PAGE分析,结果显示在26kD左右有阳性条带,而空质粒转化子没有;经纤溶平板实验验证,该表达蛋白具有生物活性。黄粉虫纤溶酶为一种新型强溶栓蛋白酶,开展对其真核生物基因表达的研究具有重要意义,本研究的实施构建了真核表达黄粉虫胰蛋白酶样酶工程菌,为一种新型溶栓基因工程药物的诞生奠定重要的理论与实验基础。

关键词：黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶质粒ppic9k 毕赤酵母菌体GS115 真核表达

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β-1，4-半乳糖基转移酶在毕赤酵母中的克隆、表达及活性测定

β-1，4-半乳糖基转移酶在毕赤酵母中的克隆、表达及活性测定

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作者：金慧浙江大学

学位级别：硕士

β-1,4-半乳糖基转移酶(β-1,4-galactosyltransferase,β-1,4-GT)是一种Ⅱ型膜结合糖蛋白,通常认为是一种管家基因产物,是至今研究最多的糖基转移酶之一。β-1,4-GT利用尿苷二磷酸半乳糖(UDP-galactose,UDP-Gal)作为激活的糖供体,把半... 详细信息

β-1,4-半乳糖基转移酶(β-1,4-galactosyltransferase,β-1,4-GT)是一种Ⅱ型膜结合糖蛋白,通常认为是一种管家基因产物,是至今研究最多的糖基转移酶之一。β-1,4-GT利用尿苷二磷酸半乳糖(UDP-galactose,UDP-Gal)作为激活的糖供体,把半乳糖转移到N-多糖复合物末端的N-乙酰基葡萄糖胺上。它不仅存在高尔基体上,而且整合于细胞质膜上,并表现不同的生物学功能。巴斯德毕赤酵母外源基因表达系统已经成功表达了很多胞间和胞内型蛋白质。该系统具有细胞繁殖快、培养条件廉价、遗传操作简单、易于工业化生产等原核表达系统的特点,又具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力,避免了包涵体变性、复性,及复性后产物活性低甚至无生物学活性等问题,非常有利于真核基因的表达。本文采用降落PCR技术,以含有β-1,4-GT基因的pGEX-4T-2质粒为模板对β-1,4-GT基因进行克隆改造,测定了克隆获得的DNA片段,与已知的基因序列一致。将克隆获得基因插入到毕赤酵母表达载体ppic9k的多克隆位点EcoRⅠ和Not Ⅰ之间,构建了重组分泌表达质粒ppic9k-GT。应用电穿孔法将线性化的重组表达质粒转入宿主感受态细胞GS115,经筛选获得β-1,4-GT多拷贝整合酵母工程菌Pochia pastoris GS115。在0.5%(v/v)甲醇诱导下,工程菌Pochia pastoris GS115成功分泌了β-1,4-GT。将SDS-PAGE蛋白电泳进行密度扫描,显示β-1,4-GT占总分泌蛋白的35%。用Sephadex G-75凝胶过滤来纯化分泌蛋白,最终得率为92mg/L。将在1分钟内能转化1nmol底物所需的酶量定义为一个酶活力单位。利用苯酚红会随H浓度改变在557nm光密度值变化的特点,测定β-1,4-GT的酶活为98.6U,酶的比活力为21.43U/mg。同时对胞外分泌和胞内蛋白的酶活进行了比较。我们的研究为日后对β-1,4-GT进行更广泛深入的研究,以及工业化生产有活性的β-1,4-GT奠定了基础。

关键词： β-1,4-半乳糖基转移酶(β-1,4-GT) 真核表达毕赤酵母表达系统质粒ppic9k GS115菌株分泌表达

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