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EML3与H3K4M融合蛋白表达质粒的构建及蛋白的表达与纯化

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中国科技论文在线精品论文

中国科技论文在线精品论文 2024年第1期17卷 79-90页

作者：王卓文刘艳丽苏州大学药学院江苏苏州215000

目的:研究获得N端/C端融合组蛋白H3K4M小肽的EML3融合蛋白的方法。方法:将组蛋白H3(aa1~15)小肽编码区融合进表达EML3 Agenet结构域重组质粒中,得到N端/C端融合表达H3K4M的质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经扩大培养,加入IPTG后在15... 详细信息

目的:研究获得N端/C端融合组蛋白H3K4M小肽的EML3融合蛋白的方法。方法:将组蛋白H3(aa1~15)小肽编码区融合进表达EML3 Agenet结构域重组质粒中,得到N端/C端融合表达H3K4M的质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经扩大培养,加入IPTG后在15℃条件下诱导6×His标签EML3融合蛋白的表达。经镍柱亲和层析及凝胶过滤层析进行纯化后,通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测蛋白的纯度。结果:通过质粒单点突变、质粒酶切、PCR克隆以及同源重组连接,成功构建EML3 N/C端融合组蛋白H3K4M的重组质粒,测序证实序列正确,而且重组质粒可在大肠杆菌中成功诱导融合蛋白的表达。其中EML3C端融合组蛋白H3K4M可通过凝血酶酶切从而得到游离的H3K4M小肽以及EML3 Agenet结构域蛋白。结论:成功构建EML3融合组蛋白H3K4M重组质粒,并诱导表达及纯化得到高纯度的EML3融合蛋白。

关键词：微生物药物学组蛋白H3K4M小肽 EML3 Agenet结构域融合蛋白质粒构建蛋白表达纯化

NDUFS6蛋白生物信息学分析及过表达质粒的构建与鉴定

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宁夏医科大学学报 2024年第4期46卷 353-359页

作者：张瑜孙美琪徐方晶王洁方克宝王一帆何军宁夏医科大学第一临床医学院银川750004 宁夏医科大学附属银川市中医医院银川750000 宁夏医科大学总医院宁夏医科大学第一临床医学院银川750004

目的应用生物信息学方法分析线粒体呼吸链复合体Ⅰ结构亚基烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(泛素)铁硫蛋白6(NDUFS6)的理化性质,构建pCV702-NDUFS6过表达质粒并进行鉴定,为进一步研究NDUFS6蛋白功能奠定基础。方法利用Expasy、UniProtKB、... 详细信息

目的应用生物信息学方法分析线粒体呼吸链复合体Ⅰ结构亚基烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(泛素)铁硫蛋白6(NDUFS6)的理化性质,构建pCV702-NDUFS6过表达质粒并进行鉴定,为进一步研究NDUFS6蛋白功能奠定基础。方法利用Expasy、UniProtKB、NCBI、SOPMA等生物信息学工具分析NDUFS6蛋白的理化性质、二级结构等;根据NDUFS6 cDNA序列构建携带NDUFS6基因的过表达质粒pCV702-NDUFS6,转染大鼠心肌细胞H9C2,并设置阴性对照(NC)组和相应空载体CON520作为阳性对照(PC)组,经嘌呤霉素筛选后,采用RT-qPCR和Western blot检测NDUFS6 mRNA和蛋白表达水平。结果 NDUFS6蛋白由116个氨基酸组成,理论等电点pI为9.37。蛋白二级结构以无规则卷曲(占50%)为主。酶切鉴定和基因测序结果显示,pCV702-NDUFS6表达质粒构建成功。RT-qPCR和Western blot结果显示,相较于NC组和PC组,过表达组NDUFS6表达水平均上调(P均构建了能在心肌细胞H9C2中有效过表达NDUFS6基因的过表达质粒。

关键词：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(泛素)铁硫蛋白6 生物信息学分析心肌细胞质粒构建

定向敲除牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA的重组质粒构建

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中华口腔医学杂志 2012年第11期47卷 671-674页

作者：杨洁刘玉吴娟孙卫斌李宽钰南京大学口腔医学院-南京市口腔医院牙周科 210008 南京大学医学院江苏省医学分子技术重点实验室

目的构建定向敲除牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis，Pg）菌毛蛋白FimA基因的质粒pPHU281_A_Spec_B，用于后续构建菌毛蛋白FimA缺陷型Pg，为研究FimA的功能奠定分子基础。方法厌氧培养PgATCC33277，提取基因组DNA，聚合酶链反... 详细信息

目的构建定向敲除牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis，Pg）菌毛蛋白FimA基因的质粒pPHU281_A_Spec_B，用于后续构建菌毛蛋白FimA缺陷型Pg，为研究FimA的功能奠定分子基础。方法厌氧培养PgATCC33277，提取基因组DNA，聚合酶链反应扩增PgFimA基因一定长度的上游A片段及下游B片段，并在扩增片段两端添加合适的酶切位点；利用定向克隆技术将A和B基因插入到载体自杀质粒pPHU281中，并添加大观霉素抗性基因片段，重组的pPHU28_1_A_Spec_B在大肠杆菌DH-5仪内扩增后酶切电泳鉴定并进行DNA测序。结果通过对重组质粒pPHU281_A_Spec_B进行酶切鉴定以及DNA序列测定分析，证明重组质粒pPHU28_1_A_Spec_B构建成功。结论成功构建了质粒pPHU28_1_A_Spec_B，有利于菌毛蛋白FimA缺陷型Pg的构建，为深入研究FimA的作用机制奠定了基础。

关键词：紫单胞菌龈菌毛蛋白质类质粒构建牙龈卟啉单胞菌 FimA 重组质粒

大鼠HO-1表达质粒构建、活力检测及抗HUVEC凋亡的作用研究

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实验生物学报 2005年第5期38卷 441-446页

作者：夏振炜齐奇张雪洪申庆祥李云珠俞善昌上海第二医科大学附属瑞金医院上海200025 上海交通大学生命科学技术学院上海200030 上海市计划生育科学研究所上海200032

异种移植排斥反应的主要特征为内皮细胞发生Ⅱ型激活,引起黏附分子、细胞因子和前促凝分子等基因高表达,造成血管收缩、白细胞黏附、激活、聚集和血栓形成,最终导致内皮细胞凋亡。保护基因HO-1通过抑制前炎症反应及免疫调抑作用以保护... 详细信息

异种移植排斥反应的主要特征为内皮细胞发生Ⅱ型激活,引起黏附分子、细胞因子和前促凝分子等基因高表达,造成血管收缩、白细胞黏附、激活、聚集和血栓形成,最终导致内皮细胞凋亡。保护基因HO-1通过抑制前炎症反应及免疫调抑作用以保护异种移植器官。因此,通过构建含剪切的野生型大鼠HO-1 cDNA的表达型质粒,用DOTAP包裹转入HUVEC中表达,测定表达量及表达产物活性;采用TNF-α诱导细胞凋亡,以及Heme和SnPP分别刺激细胞,诱导和抑制细胞内HO-1表达量,流式细胞仪测定细胞凋亡率,明确HO-1的抗细胞凋亡作用。结果显示HO-1在HUVEC中高度表达,活力为对照组5倍;TNF-α诱导细胞凋亡,但Heme处理后细胞凋亡率下降至20%以下,而SnPP处理后细胞凋亡率显著上升,最高达到95%以上,并且HO-1基因表达抑制时细胞凋亡率是诱导时的5-20倍。本实验表明Heme处理后HO-1表达上调,具有显著抗细胞凋亡作用,细胞凋亡率与HO-1表达量呈负相关,提示HO-1通过抑制细胞凋亡,对细胞有保护作用。

关键词：血红素加氧酶-1 肿瘤坏死因子-α 血红素锡-原卟啉细胞凋亡抗细胞凋亡质粒构建活力检测大鼠 TNF-α

人β防御素-2与前列腺癌特异性膜抗原嵌合蛋白真核表达质粒构建及其诱导的小鼠特异性免疫应答

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生物医学工程学杂志 2005年第2期22卷 283-287页

作者：李明孙艳冯云吴琦黄宁王伯瑶四川大学华西医学中心感染免疫研究室成都610041

探索人β防御素2 (h BD- 2 )和前列腺特异性膜抗原(PSMA)共表达重组核酸疫苗针对前列腺癌的免疫治疗。研究以pc DNA3.1为载体,构建重组质粒pc DNA3.1/PSMA和pc DNA3.1/h BD- 2 - PSMA,通过RT- PCR和免疫组化检测其表达。免疫小鼠后,进... 详细信息

探索人β防御素2 (h BD- 2 )和前列腺特异性膜抗原(PSMA)共表达重组核酸疫苗针对前列腺癌的免疫治疗。研究以pc DNA3.1为载体,构建重组质粒pc DNA3.1/PSMA和pc DNA3.1/h BD- 2 - PSMA,通过RT- PCR和免疫组化检测其表达。免疫小鼠后,进行血清中抗体检测,CD4 +、CD8+ T淋巴细胞数目测定及CTL 特异性杀伤作用检测。结果显示构建的质粒转染COS- 7细胞后能表达目的基因,免疫小鼠后能在体内持久表达,可以诱导产生特异性抗体,能有效的刺激T细胞增生,诱导特异性CTL 反应。当以h BD- 2作为免疫佐剂时,CTL 活性更强。本研究成功的构建了含PSMA的表达质粒,免疫小鼠可以诱导出有效的体液和细胞免疫。

关键词：人β防御素2 前列腺特异性膜抗原核酸疫苗免疫小鼠前列腺癌质粒构建特异性免疫应答防御素真核表达嵌合蛋白

携带IFN-5α基因的HBV DNA质粒构建及其表达

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中华传染病杂志 2005年第2期23卷 99-103页

作者：万辉万谟彬宋玉薛建亚第二军医大学附属长海医院感染科上海200433

目的构建携带人IFN5α基因的X基因缺陷的HBVDNA真核表达质粒,并在真核细胞中表达。方法在pBR322BHBV质粒(含adrⅠ型HBVDNA)中插入人工合成片段破坏其HBV-X基因区,再与IFN5α片段连接,最后克隆入真核表达载体pcDNA3,获得携带人IFN5α基因... 详细信息

目的构建携带人IFN5α基因的X基因缺陷的HBVDNA真核表达质粒,并在真核细胞中表达。方法在pBR322BHBV质粒(含adrⅠ型HBVDNA)中插入人工合成片段破坏其HBV-X基因区,再与IFN5α片段连接,最后克隆入真核表达载体pcDNA3,获得携带人IFN5α基因的X基因缺陷的HBVDNA真核表达质粒pcDNA3-KN-F1F2-IFN-5α。同时构建两组对照质粒,即连接完整HBVDNA的真核表达质粒和连接X基因缺陷的HBVDNA真核表达质粒,将上述3种质粒以脂质体法同时转染HepG2细胞,G418筛选出稳定表达系统后选用荧光定量PCR法、ELISA法、RTPCR法检测3种包装病毒的复制表达以及IFN5α的表达水平。结果获得目的真核表达质粒pcDNA3-KN-F1F2-IFN-5α;目的质粒转染HepG2细胞后其包装病毒的复制表达水平均较两个对照组降低;插入的IFN-5α片段可以在mRNA以及蛋白质水平表达。结论成功构建携带人IFN-5α基因的X基因缺陷的HBVDNA真核表达质粒,并能在HepG2真核细胞中表达。

关键词： HBV DNA真核表达质粒 5α 质粒构建 HepG2细胞荧光定量PCR法基因缺陷真核表达载体 ELISA法 PCR法检测真核细胞蛋白质水平 α基因人工合成脂质体法表达系统 mRNA adr 基因区片段连接 RT- 对照组插入转染病毒

电离辐射致线粒体DNA 4977 bp缺失质粒构建及其鉴定

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中华放射医学与防护杂志 2006年第1期26卷 52-54页

作者：陈晓穗封江彬周丽君陆雪王欲晓陈德清曲佳刘青杰海军总医院北京100037 中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所

目的建立电离辐射诱导的人线粒体DNA(mtDNA)4977 bp缺失片段和对照DNA片段的稳定质粒,用于线粒体基因组相关研究。方法对无mtDNA 4977 bp缺失的正常人外周血进行离体照射10 Gy60Coγ射线,提取细胞总DNA,用巢式PCR扩增mtDNA 4977 bp缺失... 详细信息

目的建立电离辐射诱导的人线粒体DNA(mtDNA)4977 bp缺失片段和对照DNA片段的稳定质粒,用于线粒体基因组相关研究。方法对无mtDNA 4977 bp缺失的正常人外周血进行离体照射10 Gy60Coγ射线,提取细胞总DNA,用巢式PCR扩增mtDNA 4977 bp缺失片段,普通PCR扩增对照ND1基因片段。PCR产物经纯化后构建质粒;提取质粒DNA,DNA样品经酶切、纯化后测序,将测序结果进行BLAST分析。结果PCR扩增的跨mtDNA 4977 bp缺失的DNA片段和ND1基因片段大小与预期值是吻合的。对制备的质粒DNA样品进行测序,结果经BLAST分析,两种质粒DNA与人线粒体序列同源性在99%以上。结论本研究中所构建的质粒是成功的,可以用于人mtDNA4977 bp缺失的定性或定量研究。

关键词：电离辐射线粒体DNA 4977 bp缺失质粒构建鉴定

酵母双杂交 BBTV DNA2 ORF诱饵质粒构建及其互作蛋白筛选

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植物病理学报 2015年第4期45卷 376-383页

作者：余乃通王健华张雨良周朋刘志昕中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海口571101

香蕉束顶病毒DNA2组分编码蛋白的功能尚不清楚,为了揭示其编码蛋白的功能,以本实验室保存的BBTV Haikou4分离物总DNA为模板进行PCR扩增,利用Gateway重组技术将BBTV DNA2 ORF构建到酵母双杂交系统(Pro QuestTM Two-Hybrid System,Invitro... 详细信息

香蕉束顶病毒DNA2组分编码蛋白的功能尚不清楚,为了揭示其编码蛋白的功能,以本实验室保存的BBTV Haikou4分离物总DNA为模板进行PCR扩增,利用Gateway重组技术将BBTV DNA2 ORF构建到酵母双杂交系统(Pro QuestTM Two-Hybrid System,Invitrogen)的诱饵载体pDEST-32中,并通过酵母表型验证、诱饵质粒毒性验证以及自激活验证。结果显示,转有pDEST32-DNA2 ORF质粒的Ma V203酵母菌具有弱的自激活背景,在3-AT浓度为25 mmol/L的Se C-Leu-TrpHis平板上生长较弱,但在3-AT浓度为50 mmol/L Se C-Leu-Trp-His平板上不生长,表明诱饵质粒背景自激活可被浓度为50 mmol/L的3-AT所抑制。在该条件下共转pDEST32-DNA2 ORF和文库质粒到MaV203感受态细胞进行互作蛋白筛选,通过PCR和测序等手段最终鉴定35个候选蛋白基因,分别编码转录调控因子、生长发育相关蛋白、代谢相关蛋白、抗逆相关蛋白和未知蛋白等。酵母双杂交BBTV DNA2 ORF诱饵质粒的构建及其与寄主互作蛋白的筛选,为揭示DNA2组分的蛋白功能提供了科学线索。

关键词： DNA2ORF 酵母双杂交质粒构建自激活验证

野生型和C279G突变型UCHL1基因真核表达质粒构建

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上海第二医科大学学报 2005年第5期25卷 455-458页

作者：巴茂文刘振国倪培华陈生弟李琳陆国强上海第二医科大学瑞金医院神经内科帕金森病诊疗与研究中心上海200025 上海第二医科大学瑞金医院检验医学中心上海200025 上海第二医科大学新华医院神经内科

目的构建人野生型和C279G突变型pEGFP-N1-UCHL1质粒。方法采用RT-PCR方法从人胚脑组织中扩增出人泛素羧基末端水解酶1(UCHL1)基因,插入至pMD18Tvector中;再采用SOE法定点突变,通过酶切和连接,构建野生型和C279G突变型pEGFP-N1UCHL1。结... 详细信息

目的构建人野生型和C279G突变型pEGFP-N1-UCHL1质粒。方法采用RT-PCR方法从人胚脑组织中扩增出人泛素羧基末端水解酶1(UCHL1)基因,插入至pMD18Tvector中;再采用SOE法定点突变,通过酶切和连接,构建野生型和C279G突变型pEGFP-N1UCHL1。结果酶切和DNA测序证实,野生型和突变型UCHL1基因分别插入到pEGFP-N1中,野生型UCHL1基因序列与GenBank完全一致,C279G突变型UCHL1基因除第279位碱基C被G替代以外,其余序列与野生型完全一致。结论成功构建野生型和C279G突变型UCHL1基因真核表达质粒。

关键词： UCHL1 突变型基因真核表达质粒构建 RT-PCR方法真核表达质粒 L1基因 DNA测序人野生型羧基末端胚脑组织定点突变基因序列水解酶 SOE 基因分插入酶切