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重组大肠杆菌催化合成谷胱甘肽的研究

西北大学学报（自然科学版） 2003年第5期33卷 554-557页

作者：沈立新魏东芝尧辉西北大学化工学院陕西西安710069 生物反应器工程国家重点实验室华东理工大学生物化学研究所上海200237

利用PCR技术扩增编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH )及谷胱甘肽合成酶(GSH )的基因,并进行了部分序列分析,分别构建了表达质粒pTrc-gsh 和pTrc-gsh ,它们在***21中的稳定性很好。在***21(pTrc-gsh )∶***21(pTrc-gsh )=3∶1的情况下,谷... 详细信息

利用PCR技术扩增编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH )及谷胱甘肽合成酶(GSH )的基因,并进行了部分序列分析,分别构建了表达质粒pTrc-gsh 和pTrc-gsh ,它们在***21中的稳定性很好。在***21(pTrc-gsh )∶***21(pTrc-gsh )=3∶1的情况下,谷胱甘肽的合成达3.31g/L,高于工程菌***21(pTrc-gsh)催化合成的谷胱甘肽的量(2.51g/L)。利用***21(pTrc-gsh )与***21(pTrc-gsh )将γ-谷氨酰半胱氨酸的合成与谷胱甘肽的合成分步进行,谷胱甘肽的合成达3.78g/L,比利用***21(pTrc-gsh)采用两步法合成的谷胱甘肽高42.1%,解决了GSH对GHI的反馈抑制,并降低了ADP对第二步反应的抑制程度。

关键词： γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶谷胱甘肽合成酶克隆谷胱甘肽合成

酿酒酵母菌关键酶基因剔除对谷胱甘肽及氨基酸合成的影响

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酿酒酵母菌关键酶基因剔除对谷胱甘肽及氨基酸合成的影响

作者：梁伟东兰州大学

学位级别：硕士

谷胱甘肽是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的一种同时含有γ-谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物。谷胱甘肽在生物体内具有多种重要的生理功能,特别是对于维持生物体内适宜的氧化还原环境起着至关重要的作用,在临床医药、食... 详细信息

谷胱甘肽是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的一种同时含有γ-谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物。谷胱甘肽在生物体内具有多种重要的生理功能,特别是对于维持生物体内适宜的氧化还原环境起着至关重要的作用,在临床医药、食品工业、体育运动及有关生物研究领域有着广泛的用途。γ-胱硫醚裂解酶(γ-CTLase)和β-胱硫醚合成酶(β-CTSase)是酿酒酵母半胱氨酸合成通路上的关键酶,调控两种酶的相应基因分别是CYS3和CYS4;γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶分别是谷胱甘肽生物合成第一步和第二步反应的关键酶,调控两种酶的基因分别是GSH1和GSH2。利用基因重组技术分别构建CYS3基因剔除菌、CYS4基因剔除菌和GSH1基因剔除菌和GSH2基因剔除菌,然后通过对比野生菌与突变酵母菌生长曲线并定量检测两者中谷胱甘肽和氨基酸的含量,得出CYS3基因、CYS4基因和GSH1基因和GSH2基因剔除对谷胱甘肽和氨基酸代谢的影响程度。根据摇瓶实验结果,与野生菌株相比,CYS3基因剔除菌中谷胱甘肽含量降低了26.1%,CYS4基因剔除菌中谷胱甘肽含量提高了6%,GSH1基因剔除菌中谷胱甘肽含量降低了18.5%,GSH2基因剔除菌中谷胱甘肽含量降低了4.17%。这对谷胱甘肽合成工艺提供了理想依据,也就是说CYS4基因突变能提高合成谷胱甘肽的量;而CYS3基因和GSH1基因的剔除使得谷胱甘肽合成量明显下降,提示克隆此两种关键酶做成基因工程菌能显著提高谷胱甘肽合成的产量。综合CYS3、CY4和GSH1、GSH2基因剔除和其它在谷胱甘肽代谢途径中关键酶基因剔除实验结果所得数据,可以建立酿酒酵母谷胱甘肽代谢网络系统生物学模型。

关键词：基因剔除 SFH-PCR γ-胱硫醚裂解酶 β-胱硫醚合成酶 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶谷胱甘肽合成酶谷胱甘肽合成系统生物学

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催化合成谷胱甘肽的基因工程菌的构建及表达

西北药学杂志 2010年第4期25卷 288-291页

作者：沈继朵胡晓川卞筱泓许激扬中国药科大学生物化学教研室江苏南京210009 青岛市中心医院乳腺外科山东青岛266042

目的利用基因工程菌合成谷胱甘肽。方法克隆γ-谷氨酰转肽酶,构建重组质粒pET30a-GGT,乳糖诱导融合蛋白的表达,利用pET30a-GGT/***21和pET32a-GSH-II/***21分两步法合成γ-谷氨酰半胱氨酸与谷胱甘肽。结果工程菌的最佳乳糖诱导条件为:浓... 详细信息

目的利用基因工程菌合成谷胱甘肽。方法克隆γ-谷氨酰转肽酶,构建重组质粒pET30a-GGT,乳糖诱导融合蛋白的表达,利用pET30a-GGT/***21和pET32a-GSH-II/***21分两步法合成γ-谷氨酰半胱氨酸与谷胱甘肽。结果工程菌的最佳乳糖诱导条件为:浓度3mmoL.L-1、时间6h、温度28℃。工程菌经最佳条件诱导后,γ-谷氨酰转肽酶的酶活大约是出发菌株***5α的21倍,酶活力得到明显提高,谷胱甘肽的产量达到0.524g.L-1。结论成功地为今后利用基因工程菌催化合成谷胱甘肽寻找到一种新的方法。

关键词： γ-谷氨酰转肽酶克隆表达谷胱甘肽合成

基于调控星形胶质细胞代谢的1,6-二磷酸果糖抗癫痫机制研究

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基于调控星形胶质细胞代谢的1,6-二磷酸果糖抗癫痫机制研究

作者：钱恒浙江大学

学位级别：硕士

研究目的:癫痫是一种复杂的神经系统综合征,神经元异常放电引起的癫痫发作是其主要临床表现,药物治疗是控制癫痫发作的主要手段。现有药物主要作用于突触离子通道和神经递质受体从而抑制癫痫发作,但是对疾病本身及认知功能降低等神经精... 详细信息

研究目的:癫痫是一种复杂的神经系统综合征,神经元异常放电引起的癫痫发作是其主要临床表现,药物治疗是控制癫痫发作的主要手段。现有药物主要作用于突触离子通道和神经递质受体从而抑制癫痫发作,但是对疾病本身及认知功能降低等神经精神并发症无效,甚至可能加重神经精神症状。越来越多的研究证实代谢紊乱与癫痫发生发展密切相关,其中星形胶质细胞代谢紊乱可能起到重要作用。我们前期研究发现,糖酵解中间产物1,6-二磷酸果糖(FBP)具有显著抗癫痫作用,不仅能抑制癫痫发作而且可以改善慢性癫痫动物的认知功能。本课题旨在围绕核心科学假说——FBP可以协同调控星形胶质细胞的糖代谢和谷氨酸代谢,从而发挥防治癫痫发作、修复脑损伤的作用——阐明FBP的新颖抗癫痫机制,从而揭示FBP较现有抗癫痫药物的特点及优势。研究内容:(1)FBP对慢性癫痫的治疗作用及其作用特点:用毛果芸香碱诱导的慢性自发性颞叶癫痫模型,对比研究一线抗癫痫药包括丙戊酸钠和左乙拉西坦,和FBP于给药期间和停药后的抗癫痫发作药效;用Morris水迷宫试验评价一线抗癫痫药和FBP对癫痫动物学习记忆能力的影响。(2)探究FBP抑制糖酵解作用与其抑制癫痫发作的关系:采用清醒动物脑微透析的方法研究FBP对慢性癫痫动物发作间期和发作期乳酸水平和神经递质水平的影响;随后于毛果芸香碱诱导的急性癫痫发作模型中利用靶向工具药阻断乳酸穿梭,以观察其对急性癫痫发作、乳酸水平和神经递质水平的影响,从而对比分析FBP的作用方式和作用特点。(3)探究FBP对星形胶质细胞糖代谢和谷氨酸代谢的影响:利用同位素标记的谷氨酸钠联合质谱检测分析FBP处理对谷氨酸在人星形胶质细胞HA细胞中多条代谢通路的影响,包括进入三羧酸循环代谢、流向谷胱甘肽(GSH)合成和经由经典通路转化为谷氨酰胺等。(4)采用免疫组织化学的方法考察FBP对慢性癫痫动物海马区的神经保护作用。实验结果:(1)FBP在慢性癫痫模型中表现出相较于阳性药物更快速、更稳定、更持久的抑制癫痫发作的效果,特别是在停药后仅有FBP组动物能够维持抗癫痫效果;同时仅有FBP对慢性癫痫动物的学习能力具有改善作用。(2)FBP可以对抗癫痫发作诱导因素引起的慢性癫痫动物海马区乳酸水平升高,维持发作间期谷氨酸水平处于正常水平,并恢复谷氨酸能神经元对外界刺激的正常响应;两个不同靶点的乳酸穿梭阻断剂均能显著对抗癫痫发作,其中单羧酸转运体抑制剂强烈升高细胞间隙乳酸水平而乳酸脱氢酶抑制剂表现出明显抑制,二者均显著抑制谷氨酸水平使其大大低于正常水平;这种不同指出,FBP并非单纯地抑制星形胶质细胞糖酵解或乳酸穿梭而是调控其代谢活动和与此关联的神经递质代谢过程。(3)FBP可差别地调控HA细胞的糖代谢和谷氨酸代谢:FBP抑制糖酵解活动并促进葡萄糖进入三羧酸循环,但不影响其流向GSH合成通路;促进谷氨酸进入三羧酸循环氧化分解或进一步流向天冬氨酸合成,选择性促进胞外谷氨酸流向GSH合成并释放到细胞外,也同时促进谷氨酸转化为谷氨酰胺。(4)FBP改善慢性癫痫动物海马脑区星形胶质细胞和神经元随疾病发展而出现的退化。研究结论:一方面,FBP通过调控星形胶质细胞糖酵解稳定慢性癫痫动物脑内乳酸水平从而有利于抑制癫痫急性发作;另一方面FBP促进星形胶质细胞三羧酸循环,增强其谷氨酸清除能力并促进谷氨酸转化为脑内重要的抗氧化物质谷胱甘肽,从而将引发癫痫发作及神经退化的毒性物质快速转化为具有神经保护作用的物质。以上作用合理地解释了 FBP兼具抑制癫痫发作和促进癫痫脑组织结构和功能修复的药效特色和优势。研究结果不仅为后续开发FBP为新型抗癫痫药物提供了药效和理论依据,也为研发更加安全有效的新型抗癫痫药物提供了线索。

关键词：癫痫代谢调控星形胶质细胞谷氨酸稳态谷胱甘肽合成

基于代谢组学的冬凌草甲素抑制宫颈癌细胞增殖的分子机制研究

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基于代谢组学的冬凌草甲素抑制宫颈癌细胞增殖的分子机制研究

作者：王凯莉郑州大学

学位级别：硕士

研究背景:宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。目前,化疗和手术是宫颈癌临床治疗的常用策略。但由于化疗药物严重的毒副作用以及术后并发症等问题,导致其临床应用存在一定的局限性。因此,开发低毒副作用的新型有效抗肿瘤药物已成为目前... 详细信息

研究背景:宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。目前,化疗和手术是宫颈癌临床治疗的常用策略。但由于化疗药物严重的毒副作用以及术后并发症等问题,导致其临床应用存在一定的局限性。因此,开发低毒副作用的新型有效抗肿瘤药物已成为目前肿瘤治疗研究领域的热点。冬凌草甲素是一种具有较强的生物活性的四环二萜类天然有机化合物,具有较强的抗氧化性,可诱导多种肿瘤细胞凋亡。目前,冬凌草甲素抑制宫颈癌Hela细胞增殖的分子机制尚不清楚。基于此,本研究采用系统生物学技术研究冬凌草甲素抑制Hela细胞增殖的分子机制,以期为冬凌草甲素治疗宫颈癌提供基础理论数据支撑。研究目的:基于网络药理学和代谢组学的技术方法,分析冬凌草甲素干预后Hela细胞内的小分子差异代谢物及其相关代谢通路,从分子水平阐释冬凌草甲素抑制Hela细胞增殖的分子机制,为冬凌草甲素治疗宫颈癌提供基础理论。研究方法:1.采用MTT实验考察冬凌草甲素对Hela细胞的毒性作用,使用Graph Pad Prism软件拟合出冬凌草甲素抑制Hela细胞的IC值。2.采用流式细胞仪检测冬凌草甲素对Hela细胞周期阻滞,线粒体膜电位和凋亡的影响。3.运用网络药理学的方法,通过Pharm mapper数据库筛选出冬凌草甲素的作用靶点,通过Gene Cards数据库筛选出宫颈癌的治疗靶点,使用Cytoscape软件对冬凌草甲素作用与宫颈癌治疗的共同靶点进行网络构建,并使用R软件和DAVID数据库对共同靶点进行GO功能分析和KEGG通路分析。4.采用UPLC-MS/MS的代谢组学技术分析冬凌草甲素对Hela细胞内小分子代谢物的影响。通过小分子定性软件OSI/SMMS对化合物进行定性,使用SIMCA软件计算VIP值,根据VIP>1,P合成谷胱甘肽的小分子化合物半胱氨酸进行衍生化处理,使用UPLC-MS/MS测定对照组和冬凌草甲素作用组细胞内半胱氨酸的含量。6.采用酶联免疫吸附法检测冬凌草甲素对Hela细胞内谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)活性的影响。7.采用流式细胞仪检测冬凌草甲素对Hela细胞内ROS和ATP含量的影响。研究结果:***测定结果显示,随着浓度的增加,冬凌草甲素对Hela细胞的抑制率逐渐增加,呈正相关。冬凌草甲素对Hela细胞作用24 h,48 h,72 h的IC值分别为20.61μM,15.06μM和11.88μM。随着冬凌草甲素浓度的增加,停滞于G/M期的Hela细胞比率逐渐增加,线粒体膜电位呈现出明显下降的趋势,且细胞凋亡率逐渐升高。2.网络药理学结果显示,冬凌草甲素的作用靶点有280个,宫颈癌治疗靶点有838个,取交集后共获得75个靶点。对共有靶点进行网络可视化和蛋白质-蛋白质相互作用网络分析,得到AKT1,MAPK,EGFR等核心靶点。GO富集分析结果中,生物功能包括核受体活性,配体激活的转录因子活性,膜受体蛋白激酶活性等。KEGG通路分析结果包括谷胱甘肽代谢通路,m TOR信号通路,AMPK信号通路,半胱氨酸和蛋氨酸的代谢等。非靶向代谢组学的模式判别分析结果显示,在OPLS-DA模型中,对照组和冬凌草甲素作用组间明显分离,两组间无过拟合现象。共筛选出21个具有显著性差异的小分子代谢物。其中,冬凌草甲素作用后含量升高的代谢物包括谷氨酰胺、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和柠檬酸等15个。含量降低的代谢物包括谷胱甘肽、5-氧脯氨酸和谷氨酸等6个。富集分析和代谢通路分析结果显示,冬凌草甲素作用后Hela细胞内谷胱甘肽代谢、谷氨酰胺和谷氨酸代谢、缬氨酸-亮氨酸和异亮氨酸代谢、三羧酸循环、半胱氨酸和蛋氨酸的代谢等多条代谢通路发生显著性改变。3.网络药理学和代谢组学结果联合分析,提示冬凌草甲素可能通过影响谷胱甘肽的合成代谢抑制Hela细胞的增殖。对合成谷胱甘肽的上游化合物半胱氨酸的含量测定结果显示,冬凌草甲素作用后,细胞内半胱氨酸的含量显著降低;酶联免疫分析结果显示,与对照组相比,冬凌草甲素作用后,细胞内谷胱甘肽合成的关键酶GCLC的活性显著降低,表明冬凌草甲素抑制了Hela细胞内谷胱甘肽的合成。且冬凌草甲素可显著降低维持体内氧化还原平衡的GPX4的活性,使Hela细胞内ROS水平升高,表明冬凌草甲素能够增加Hela细胞内氧化应激水平,诱导Hela细胞凋亡。ATP含量测定结果显示,在冬凌草甲素给药2 h后,细胞内ATP含量已经明显降低,在2-12 h内,细胞内ATP的含量均显著低于对照组,提示冬凌草甲素可抑制Hela细胞的能量生成。研究结论:本研究采用网络药理学联合代谢组学技术从分子水平上分析了冬凌草甲

关键词：冬凌草甲素 UPLC-MS/MS 代谢组学谷胱甘肽合成半胱氨酸

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啤酒酵母的综合利用

技术与市场 2000年第7期7卷 22-23页