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经瞳孔温热疗法对大鼠视神经钳夹视网膜神经节细胞的保护作用

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眼科研究 2009年第5期27卷 385-390页

作者：刘学群姜利斌李志华张崚马瑾谢君刘磊首都医科大学附属北京同仁医院北京同仁医院眼科中心北京硕士研究生100730 长沙爱尔眼科医院长沙410015

目的探讨经瞳孔温热疗法(TTT)阈下反应对BN大鼠视神经钳夹后视网膜神经节细胞(RGCs)的保护作用。方法采用阈下TTT对BN大鼠视网膜进行照射后3d,通过逆行标记RGCs的方法,对TTT+视神经钳夹组(A组)、TTT+假手术组(B组)、单纯视神经钳夹组(C... 详细信息

目的探讨经瞳孔温热疗法(TTT)阈下反应对BN大鼠视神经钳夹后视网膜神经节细胞(RGCs)的保护作用。方法采用阈下TTT对BN大鼠视网膜进行照射后3d,通过逆行标记RGCs的方法,对TTT+视神经钳夹组(A组)、TTT+假手术组(B组)、单纯视神经钳夹组(C组)和空白对照组(D组)在视神经钳夹后1、2、4周进行RGCs计数并比较;检测视网膜TTT阈下反应的热休克蛋白70(HSP70)表达;观察TTT阈下反应对视网膜的影响。结果视神经钳夹后4周,A组RGCs数显著高于C组(P=0.006),而1周和2周时2组之间差异无统计学意义(P>0.05);各时间点B组和D组的RGCs数差异无统计学意义(P>0.05)。视网膜经阈下TTT干预后,HSP70表达高于对照眼。阈下TTT照射能引起视网膜组织形态上的改变。结论阈下TTT可显著提高视神经钳夹4周后RGCs的存活数量;其保护机制可能与诱导视网膜内源性HSP70表达、启动内源性保护机制有关。

关键词：经瞳孔温热疗法视网膜神经节细胞视神经钳夹热休克蛋白

铁死亡在大鼠视神经钳夹损伤模型中作用的实验研究

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铁死亡在大鼠视神经钳夹损伤模型中作用的实验研究

作者：郭苗天津医科大学

学位级别：硕士

研究目的:本研究旨在探索铁死亡在大鼠视神经钳夹(ONC)模型中对视网膜神经节细胞(RGC)损伤的作用,以及铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)对ONC后RGC损伤的保护作用。方法:(1)我们通过剪开结膜,暴露视神经,使用反向镊子钳夹视神经10s的... 详细信息

研究目的:本研究旨在探索铁死亡在大鼠视神经钳夹(ONC)模型中对视网膜神经节细胞(RGC)损伤的作用,以及铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)对ONC后RGC损伤的保护作用。方法:(1)我们通过剪开结膜,暴露视神经,使用反向镊子钳夹视神经10s的方法建立雄性wistar大鼠ONC模型。(2)Western-Blot实验检测大鼠视网膜中x CT(System Xc-light chain,又称为SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4,GPX4)水平。(3)丙二醛(Malondialdehyde,MDA)检测试剂盒和组织铁检测试剂盒检测视网膜中MDA和组织铁水平。(4)频域光学相干断层扫描(Spectral-domain optical coherence tomography,SD-OCT)检测大鼠视网膜结构、形态和各层厚度。(5)闪光视觉诱发电位(Flash visual evoked potential,FVEP)检测大鼠视网膜电生理功能。(6)视网膜RBPMS免疫荧光染色用来检测ONC后RGC丢失。(7)透射电镜观察大鼠RGC线粒体形态。(8)大鼠眼球石蜡切片。(9)眼球石蜡切片HE染色观察大鼠视网膜结构改变。结果:(1)与对照组视网膜相比,ONC1天和3天后的视网膜组织中x CT和GPX4含量明显下降。相反,MDA和组织铁含量明显上调。视网膜透射电镜显示,对照组RGC体积较大,膜密度较低,有正常的线粒体嵴结构,ONC1天和3天后的RGC体积缩小,膜密度增加,线粒体嵴结构破坏。(2)玻璃体腔内分别注射0.1%DMSO和1m M Fer-1后1天、3天、7天、14天后进行眼底照相、OCT,并在14天时处死老鼠进行眼球石蜡切片HE染色。结果显示与对照组比均无显著性差异,表明0.1%DMSO和1m M Fer-1玻璃体腔注射对视网膜是没有毒性的。(3)大鼠ONC后玻璃体腔注射铁死亡抑制剂Fer-1(1m M),可以避免ONC引起的视网膜组织中x CT和GPX4的下调,同时避免ONC引起的MDA和组织铁含量的上调。(4)大鼠玻璃体腔注射高浓度Fer-1(1m M)可挽救ONC7天后的RGC丢失。ONC+空载体组、ONC+低浓度Fer-1组(10u M),ONC+高浓度Fer-1(1m M)组RGC数目占对照组的比例分别约为39%±4%、40%±6%、64%±2%。ONC后,RGC数目减少了61%左右(P神经纤维层+神经节细胞层)厚度分别为37.08±2.387um、15.20±2.174 um、16.63±1.976 um、30.60±1.602 um,NFL+GCL+IPL(神经纤维层+神经节细胞层+内丛状层)的厚度分别为113.2±2.787 um、89.53±3.655 um、88.72±7.683 um、106.4±6.403 um,TRT(视网膜全层)的厚度分别为299.5±5.933 um、283.5±11.33 um、284.3±15.02 um、325.0±26.02 um。对照组,ONC+空载体组,ONC+高浓度Fer-1组的N1-P1波振幅分别为12.10±1.800uv、3.635±1.495uv、8.423±0.6809uv,P1-N2波振幅分别为14.50±1.652uv、4.255±0.4884uv、9.233±2.270uv,N1波潜伏期分别为43.67±1.528ms、71.50±20.98ms、35.50±13.43ms,P1波潜伏期分别为68.67±3.215ms、108.5±22.65ms、59.00±10.89ms。结论:(1)铁死亡引起ONC后的RGC损伤。(2)玻璃体腔分别注射0.1%DMSO和1m M Fer-1,在注射后1天、3天、7天、14天对视网膜是没有毒性的。(3)铁死亡抑制剂Fer-1可以避免ONC后视网膜中铁死亡标志物的诱导。(4)铁死亡抑制剂Fer-1可以挽救大鼠ONC7天后RGC的丢失。(5)铁死亡抑制剂Fer-1可以改善ONC后的FVEP功能和增加SD-OCT上视网膜各层的厚度,表明

关键词：铁死亡视神经钳夹 Ferrostatin-1 程序性细胞死亡

Thy1-YFP转基因小鼠视网膜神经节细胞的存活率

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武汉大学学报（医学版） 2024年第1期45卷 8-13页

作者：何雪俊王祉祎张宁致杨宁邢怡桥武汉大学人民医院眼科中心湖北武汉430060

目的:研究转基因小鼠Thy1-YFP在视神经钳夹(ONC)模型和谷氨酸兴奋性毒性(NMDA)模型中YFP阳性视网膜神经节细胞(YFP^(+)RGCs)的存活率与总体RGCs(RBPMS^(+)RGCs)的存活率差异,以期为Thy1-YFP小鼠在视神经退行性病变中的进一步研究提供实... 详细信息

目的:研究转基因小鼠Thy1-YFP在视神经钳夹(ONC)模型和谷氨酸兴奋性毒性(NMDA)模型中YFP阳性视网膜神经节细胞(YFP^(+)RGCs)的存活率与总体RGCs(RBPMS^(+)RGCs)的存活率差异,以期为Thy1-YFP小鼠在视神经退行性病变中的进一步研究提供实验数据支持。方法:8周龄Thy1-YFP小鼠(雌雄不限)共20只,采用随机数字表法将小鼠随机分为正常组、ONC模型组和NMDA模型组。正常组小鼠进行左右眼对照;模型组小鼠均采用单眼造模,对侧眼为对照眼。其中,ONC小鼠于钳夹后7 d取材,NMDA小鼠于NMDA玻璃体腔注射后24 h取材。取材后,通过全视网膜铺片荧光染色和激光共聚焦拍照的方式获取RGCs信息,利用Image J计数YFP^(+)RGCs和总体RBPMS^(+)RGCs。统计分析ONC模型和NMDA模型中YFP^(+)RGCs的存活率与总体RBPMS^(+)RGCs的存活率差异,存活率差异以实验眼与对照眼的YFP^(+)RGCs(或RBPMS^(+)RGCs)的密度比值计算。结果:Thy1-YFP转基因小鼠视网膜上YFP^(+)RGCs和RBPMS^(+)RGCs的平均密度左右眼一致,具有可比性,其中YFP^(+)RGCs约占总RGCs的0.19%。在ONC模型中,与对照眼相比,ONC眼的YFP^(+)RGCs与RBPMS^(+)RGCs的密度都出现了大幅度下降。YFP^(+)RGCs的平均存活率为(59.4±8.2)%,而RBPMS^(+)RGCs为(33.0±1.7)%,差异达26.4%(P视神经退行性病变中的研究提供了数据支持,进一步加深了研究者对于Thy1-YFP转基因小鼠的认识,为将来的研究提供了方向和借鉴。

关键词：视神经钳夹谷氨酸兴奋性毒性反应视网膜神经节细胞存活率

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视神经损伤后发生非折叠蛋白反应的超微证据

国际眼科杂志 2009年第7期9卷 1245-1247页

作者：陈昕源段丽潘峰张欲凯沈学锋胡丹第四军医大学西京医院眼科中国陕西省西安市710033 第四军医大学神经科学研究所中国陕西省西安市710032

目的:探索视神经损伤后视网膜节细胞(retinal ganglion cell,RGC)及其纤维渐进性死亡机制。方法:利用包埋前与包埋后免疫金细胞化学标记技术结合电镜观察研究大鼠(n=15)视神经钳夹损伤后RGC与视神经干少突胶质细胞内的非折叠蛋白反应(un... 详细信息

目的:探索视神经损伤后视网膜节细胞(retinal ganglion cell,RGC)及其纤维渐进性死亡机制。方法:利用包埋前与包埋后免疫金细胞化学标记技术结合电镜观察研究大鼠(n=15)视神经钳夹损伤后RGC与视神经干少突胶质细胞内的非折叠蛋白反应(unfolding protein response,UPR)。结果:视神经钳夹后,需肌醇酶1(inositol requiring enzyme 1,IRE1)在RGC与少突胶质细胞内胶体金标记数目增多,在钳夹0.5d后RGC内即有显著地增加(18.4±5.1～30.4±7.2个,P钳夹3d后达高峰(48.5±9.7个),IRE1在视神经干上的少突胶质细胞内增多时程变化与在RGC内相似。IRE1在RGC与少突胶质细胞内胶体金标记颗粒分布部位距离ER管腔距离增加为特征,在钳夹0.5d内神经干少突胶质细胞以及视网膜RGC内均表现非常明显的距离增加。结论:视神经钳夹导致损伤细胞触发UPR,UPR可能参与视神经损伤后RGC及其纤维渐进性死亡机制。

关键词：非折叠蛋白反应视网膜节细胞少突胶质细胞电镜视神经钳夹大鼠

N-甲基-D-天冬氨酸对视网膜视杆双极细胞的损伤作用及其机制

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N-甲基-D-天冬氨酸对视网膜视杆双极细胞的损伤作用及其机制

作者：沈雨濛武汉大学

学位级别：硕士

第一部分NMDA诱导急性青光眼模型中视网膜视杆双极细胞损伤的特征目的:研究N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）诱导小鼠急性非高眼压性青光眼模型中视网膜视杆双极细胞损伤的特征。方法:随机选取3周龄的C57BL/6J小鼠,均以... 详细信息

第一部分NMDA诱导急性青光眼模型中视网膜视杆双极细胞损伤的特征目的:研究N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）诱导小鼠急性非高眼压性青光眼模型中视网膜视杆双极细胞损伤的特征。方法:随机选取3周龄的C57BL/6J小鼠,均以右眼为实验组、左眼为对照组,玻璃体腔内分别注射浓度为10mM的NMDA,建立视网膜兴奋损伤动物模型。在整体动物水平通过视网膜电图（electroretinogram,ERG）、在组织学水平通过视网膜冰冻切片免疫荧光染色、在细胞水平通过膜片钳技术,研究NMDA对小鼠视网膜视杆双极细胞损伤的特点。结果:玻璃体腔注射NMDA24小时后,RGC数量明显减少,视杆双极细胞胞体数量及其位于内丛状层（inner plexiform layer,IPL）的树突数量急剧减少。ERG显示a波和b波的潜伏期变化不大,但b波振幅明显下降。膜片钳给药结果表明,经过NMDA处理后的小鼠视网膜视杆双极细胞,其去极化电流被完全抑制。结论:玻璃体腔内注射NMDA可诱导RGCs的显著减少和视网膜视杆双极细胞的功能损害,与急性青光眼病理损害具有相似性,是一种新的青光眼的病理特征。第二部分NMDA诱导小鼠视网膜视杆双极细胞损伤的机制研究目的:探究NMDA诱导小鼠视网膜视杆双极细胞的损伤机制方法:随机选取3周龄的C57BL/6J小鼠,将其分为三组,均以右眼为实验组、左眼为对照组,在玻璃体腔注射10mM NMDA、NMDA（10mM）+KN93（1 nM）和NMDA（10mM）+MG132（20μg/ml）后,在组织学水平通过视网膜冰冻切片免疫荧光染色,在细胞水平通过膜片钳技术,研究KN93和MG132在NMDA损伤RBC中所起的作用。用ONX0912（200nM,30mg/kg）对小鼠进行灌胃5d后,在第4天时给小鼠右眼玻璃体腔注10 mM NMDA 3 μl,之后取视网膜进行免疫荧光染色。通过在膜片钳下取出的单细胞进行聚合酶链式反应检测单个视杆双极细胞中PKC、TRPM1、Go等G蛋白信号通路相关指标的mRNA水平。分别用前房灌注和视神经钳夹两种方法造模,在相应时间取视网膜进行免疫荧光染色,观察视网膜中RBC的情况。结果:NMDA在诱导视网膜RGCs急性凋亡的同时,视杆型双极细胞内出现功能性PKCα表达量减少的现象;CaMK Ⅱ抑制剂KN93可翻转NMDA对RBC的损伤作用,蛋白酶体抑制剂MG132和ONX0912也有同样的作用。单细胞rt-PCR 检测 NMDA 实验组中 PKC、TRPM1、Gβ3、RGS7、Gβ5 的 mRNA 含量较正常组含量降低,mGluR6、Gαo、GPR179、RGS11、GDIA、GDIB、GDIG的mRNA含量较正常组含量升高,差异均具统计学意义。在前房灌注和视神经钳夹这两种青光眼模型中,也观察到了 RBC的损伤现象。结论:玻璃体腔内注射NMDA在诱导急性RGCs凋亡,并且这种损伤是通过升高或者下调G蛋白信号通路上的相关蛋白和微调蛋白实现的,可通过细胞内CaMK Ⅱ和蛋白酶体影响视杆型双极细胞的生理功能。RBC在不同的青光眼模型中的损伤现象具有一定的普遍性。

关键词：青光眼动物模型视杆双极细胞 NMDA 兴奋毒性双极细胞 PKCα 膜片钳 CaMK Ⅱ 蛋白酶体抑制剂前房灌注视神经钳夹

PD-1/PD-L1在青光眼动物模型视网膜神经节细胞损伤的研究

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PD-1/PD-L1在青光眼动物模型视网膜神经节细胞损伤的研究

作者：田雪莲四川大学

学位级别：硕士

目的:程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)是一种具有免疫抑制功能的蛋白,本研究拟通过构建小鼠视神经钳夹模型及大鼠急性高眼压模型探究PD-1/PD-L1是否参与了青光眼动物模型中视网膜神经节细胞(retinal ganglion ce... 详细信息

目的:程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)是一种具有免疫抑制功能的蛋白,本研究拟通过构建小鼠视神经钳夹模型及大鼠急性高眼压模型探究PD-1/PD-L1是否参与了青光眼动物模型中视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCS)的损伤及其作用。材料和方法:构建小鼠视神经钳夹损伤模型,通过视网膜铺片免疫荧光染色检测视神经钳夹后RGCs损伤程度及视网膜PD-1配体1(Programmed cell death protein 1 ligand 1,PD-L1)的表达情况;构建大鼠急性高眼压模型,予以PD-1通路拮抗剂干预后通过眼球石蜡切片-HE染色检测视网膜内层细胞及视网膜内层厚度变化。结果:1.小鼠视神经钳夹后RGCs数量明显减少,钳夹损伤后3天RGCs数量减少49.51%,钳夹损伤后7天RGC数量减少79.26%,本实验模型是成功的。***-L1在小鼠视神经钳夹后的视网膜深层和浅层均表达上调。***-L1在小鼠视神经钳夹后随着造模时间的推移其表达进一步升高。4.大鼠急性前房灌注后视网膜内层细胞肿胀,且在灌注后1天细胞肿胀最明显,给药组的视网膜细胞肿胀更明显。5.大鼠急性前房灌注后后极部视网膜内层厚度增加,灌注后3天给药组的后极部视网膜内层厚度显著增加。结论:***-L1在小鼠视神经钳夹后的视网膜深层和浅层均表达上调;***-L1在小鼠视神经钳夹后随着造模时间的推移其表达进一步升高;***-1拮抗剂的干预加重了大鼠急性前房灌注后视网膜内层的损伤程度。

关键词：程序性死亡蛋白1 程序性死亡蛋白1配体1 青光眼视网膜神经节细胞急性高眼压视神经钳夹