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牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白的生物信息学分析及多表位筛选

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中国畜牧兽医 2019年第12期46卷 3475-3485页

作者：何金科杨亚军邓肖玉何延华张超马忠臣王勇陈创夫石河子大学生命科学学院石河子832000 石河子大学动物科技学院石河子832000

本研究旨在对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3蛋白进行生物信息学分析及T细胞和B细胞表位的筛选。从GenBank数据库中找到NS3蛋白的氨基酸序列,用Expasy ProtParam在线服务器分析所得序列理化性质。使用TMHMM Server分析跨膜结构域,使用DNASta... 详细信息

本研究旨在对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3蛋白进行生物信息学分析及T细胞和B细胞表位的筛选。从GenBank数据库中找到NS3蛋白的氨基酸序列,用Expasy ProtParam在线服务器分析所得序列理化性质。使用TMHMM Server分析跨膜结构域,使用DNAStar软件预测NS3蛋白的二级结构,为了更准确地预测蛋白质的二级结构,使用SOPMA分析软件进行了二次预测。使用Phyre2在线服务器预测NS3蛋白的三级结构,并用Raswin软件标出各个元素所处的位置。使用4种预测软件(BCPREDS、ABCpred、BepiPred和SVMTriP)分析NS3蛋白的线性B细胞表位,使用NetMHCⅡpan预测CD4+T细胞表位,使用NetBoLApan和IEDB预测CD8+T细胞表位,将所得到的结果进行T细胞和B细胞表位筛选。结果表明,NS3蛋白质由683个氨基酸组成,分子质量为75 ku,理论等电点(pI)为8.31,化学式为C 3347 H 5346 N 916 O 1009 S 28,不稳定系数为35.93,平均亲水性(GRAVY)值为-0.267,表明NS3为稳定性亲水蛋白质。TMHMM结果显示,NS3蛋白不具有跨膜结构域。SOPMA结果表明,在NS3蛋白的二级结构中,α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲分别约占30.75%、22.55%、8.35%和38.35%,用DNAStar软件分别标出了α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲所处的位置。运用4种不同的B细胞预测软件筛选出8个线性表位:12-16、289-298、349-360、394-407、421-432、489-498、515-525和665-679位氨基酸。用NetMHCⅡpan筛选出4个T细胞表位:248-262、315-320、400-414和482-496位氨基酸。本研究为BVDV NS3蛋白优势抗原的筛选提供了理论依据。

关键词：牛病毒性腹泻病毒(BVDV) NS3蛋白生物信息学分析 B细胞 T细胞表位筛选

Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白B的表位筛选与鉴定及糖蛋白D的真核表达

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Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白B的表位筛选与鉴定及糖蛋白D的真核表达

作者：姜德玉西北农林科技大学

学位级别：硕士

Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus 2,HSV-2)感染可造成一种常见而古老的性传播疾病——生殖器疱疹,其发病率在性病中仅次于淋病和梅毒。在HSV-2的11种糖蛋白中gD能诱导产生相对较高的中和抗体水平,gB可诱导产生中和抗体并能引起... 详细信息

Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus 2,HSV-2)感染可造成一种常见而古老的性传播疾病——生殖器疱疹,其发病率在性病中仅次于淋病和梅毒。在HSV-2的11种糖蛋白中gD能诱导产生相对较高的中和抗体水平,gB可诱导产生中和抗体并能引起细胞毒性T细胞反应,因此成为亚单位疫苗的首选。糖蛋白B (glycoprotein B,gB)作为单纯疱疹病毒两个血清亚型的共有外膜蛋白,在维持病毒形态及病毒进入缩主细胞起着非常重要的作用。人及动物接种gB可诱发高水平的中和抗体并可以引起保护性T细胞免疫反应。因此,选取HSV-2 gB全基因序列利用生物学软件对B及HLA-A*0201限制性T细胞表位进行了预测,所筛选的B细胞中和表位能在小鼠体内诱发高水平的抗体,并且以介导Th2型免疫反应的IgG1亚型为主。同时,这两个B细胞中和表位诱发的抗体能特异性中和病毒(感染)。另外,利用免疫学方法检测从gB上筛选的T细胞表位是否能够刺激T2细胞表面稳定地产生HLA-A*0201复合物;筛选的T细胞表位在体内/外是否能够刺激产生有效的IFN-γ及有效的CD8+T细胞的杀伤作用。结果显示,预测的T细胞表位可以刺激T2细胞稳定产生HLA-A*0201复合物,并可以刺激T细胞分泌IFN-γ与CD8+T细胞毒作用。以HSV-2 333株的基因组DNA为模板扩增编码HSV-2糖蛋白D(glycoprotein D,gD)基因,与载体pFastBacⅠ连接,转化*** DH5α感受态细胞,经PCR及测序鉴定正确。将pFastBacⅠ-gD重组质粒转座至DH10Bac获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞表达重组蛋白,经对表达条件进行优化,SDS-PAGE和Western blot鉴定,成功表达了HSV-2 gD蛋白。为下一步的工作奠定了基础。

关键词： Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白B 表位筛选糖蛋白D 真核表达

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应用抗病毒抗体表位筛选的多肽文库的构建

生物化学杂志 1997年第2期13卷 235-236页

作者：杜芝燕赵云峰王全立王海涛王升启北京军事医学科学院放射医学研究所北京100850

A "fusion phase" is a filamentous virion displaying on its surface a foreign peptide fused to a coat protein (pⅢ or pⅧ),and harboring the gene for the fusion protein within its *** biotech achievements include identification of peptide molecules that mimic the structure and function of sugars and carbohydrates that are difficult to synthesize, peptides that are effective vaccines. A 78-bases template encoding twelve peptides and biothinylated primers in 5’ terminus were designed. After PCR amplification, digestion with XhoⅠ/SpeⅠ, ligation and electrotransfection, a 5 × 10 7 clone libraly was estabished. Next,screening anti-idiotype peptides by antiHIV antibodies from the peptide library is expected.

关键词：多肽文库抗病毒抗体表位筛选

汉滩病毒包膜糖蛋白嵌合DNA疫苗的细胞免疫评价及其优势表位的筛选

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转化医学电子杂志 2017年第10期4卷 26-30页

作者：张锦鹏张冠文宣国云孟强张哲郑卓驹欧阳澍毓张正姜东伯杨琨第四军医大学基础部免疫学教研室陕西西安710032 第四军医大学学员旅陕西西安710032

目的:筛选Gn和Gc抗原优势表位,为汉滩病毒疫苗研究提供方向.方法:通过构建汉坦病毒包膜糖蛋白Gn与Gc嵌合溶酶体相关膜蛋白的DNA疫苗pVAX-LAMP/Gn,pVAX-LAMP/Gc,利用酶联免疫斑点实验(ELISpot)长期评估了BALB/c小鼠体内的细胞免疫应答.结... 详细信息

目的:筛选Gn和Gc抗原优势表位,为汉滩病毒疫苗研究提供方向.方法:通过构建汉坦病毒包膜糖蛋白Gn与Gc嵌合溶酶体相关膜蛋白的DNA疫苗pVAX-LAMP/Gn,pVAX-LAMP/Gc,利用酶联免疫斑点实验(ELISpot)长期评估了BALB/c小鼠体内的细胞免疫应答.结果:在刺激T淋巴细胞的短效与长效免疫中,pVAX-LAMP/Gc组的效应优于其他组,并筛选出优势抗原表位.结论:目前许多新型汉滩病毒疫苗研究缺少细胞免疫应答评价和记忆免疫应答评价.筛选出的Gn和Gc的抗原优势表位,可以为新型汉滩病毒疫苗的研制奠定良好的基础.

关键词：汉滩病毒包膜蛋白 LAMP分子 DNA疫苗表位筛选免疫学评价

肺炎支原体黏附蛋白表位抗原的筛选、克隆表达及初步应用

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肺炎支原体黏附蛋白表位抗原的筛选、克隆表达及初步应用

纳米颗粒展示猪圆环病毒3型Cap抗原表位的免疫效果评价

2012全国临床微生物与感染免疫学术研讨会

作者：张奇舒修冰水陈坤王国华宋晓国张贺秋军事医学科学院基础医学研究所

目的利用生物信息学分析筛选肺炎支原体三个黏附蛋白的优势诊断抗原表位,克隆表达多种表位抗原,建立酶联免疫检测方法,初步用于肺炎支原体的抗体检测。方法 BioStm生物学软件分别预测肺炎支原体三个黏附蛋白抗原B细胞表位,利用大肠杆菌... 详细信息

目的利用生物信息学分析筛选肺炎支原体三个黏附蛋白的优势诊断抗原表位,克隆表达多种表位抗原,建立酶联免疫检测方法,初步用于肺炎支原体的抗体检测。方法 BioStm生物学软件分别预测肺炎支原体三个黏附蛋白抗原B细胞表位,利用大肠杆菌优势密码子优化设计其对应核苷酸序列,分片段克隆并原核表达,采用亲和层析法纯化融合抗原,应用ELISA法对纯化的抗原活性进行测定。结果获得高纯度重组表位抗原,经ELISA法检测,融合抗原P1与商品试剂盒有相同的检出率78.26%,一致性可达69.56%,P30和P116与其有一定互补性。结论利用密码子优化基因合成技术实现了Mp三种主要黏附蛋白优势表位区段在大肠杆菌中的高效表达,筛选获得的基因工程重组优势诊断表位抗原与临床肺炎支原体患者血清样本反应良好,为Mp检测的诊断试剂的研究提供了重要参考。

关键词：肺炎支原体Mp 表位筛选优势密码子 EL1SA

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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中国兽医杂志 2024年第7期60卷 1-8页

作者：李欢欢梁严予岳亚男刘亚婷白小飞陈赵媛王彦伟黄玉欣逄文强田克恭国家兽用药品工程技术研究中心河南洛阳471000 普莱柯生物工程股份有限公司河南洛阳471000

为了验证纳米颗粒展示圆环病毒3型(PCV3)衣壳蛋白(Cap)串联表位的免疫效果,本试验通过多肽的点杂交和酶联免疫斑点法(ELISPOT)筛选B细胞表位和T细胞表位,通过SpyCatcher/SpyTag(SpyCatcher和SpyTag均为纤维连接蛋白FbaB的结构域,可自发... 详细信息

为了验证纳米颗粒展示圆环病毒3型(PCV3)衣壳蛋白(Cap)串联表位的免疫效果,本试验通过多肽的点杂交和酶联免疫斑点法(ELISPOT)筛选B细胞表位和T细胞表位,通过SpyCatcher/SpyTag(SpyCatcher和SpyTag均为纤维连接蛋白FbaB的结构域,可自发形成异肽键)将表位串联并展示于E2pCD(纳米颗粒展示平台)表面,应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和透射电子显微镜(TEM)分别检测蛋白的表达情况和颗粒组装情况,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和流式细胞术分别检测纳米颗粒展示PCV3 Cap抗原表位免疫后猪血清PCV3抗体水平和外周血T淋巴细胞增殖水平。结果显示,共筛选出3个B细胞表位[P10:73~87aa(ETAISFEYYKILKMK)、P21:161~175aa(QSLFFFSRPTPWLNT)、P26:201~214aa(YGTKEVWIRYKSVL)]和3个T细胞表位[P20:153~167aa(GTTSAHPGQSLFFFS)、P21:161~175aa(QSLFFFSRPTPWLNT)、P24:185~199aa(LLWSIYVPEKTGMTD)]。SDS-PAGE检测结果显示,SpyCatcher-E2pCD、PCV3 Cap(P10-P20~P26)-SpyTag和SpyCatcher-E2pCD-PCV3 Cap(P10-P20~P26)-SpyTag分子量分别为40、16和55kDa。通过TEM可以检测到SpyCatcher-E2pCD和SpyCatcher-E2pCD-PCV3 Cap(P10-P20~P26)-SpyTag均形成直径约22 nm的纳米颗粒。免疫效果评价结果显示,免疫后21 d时,SpyCatcher-E2pCD-PCV3 Cap(P10-P20~P26)-SpyTag免疫猪产生的特异性抗体水平以及CD4^(+)、CD8^(+)和CD4^(+)CD8^(+)淋巴细胞比例均极显著高于PCV3 Cap(P10-P20~P26)-SpyTag(P表位具有较好的免疫效果,可以为PCV3候选疫苗的研制提供借鉴。

关键词：猪圆环病毒3型(PCV3) 表位筛选纳米颗粒

利用噬菌体展示技术筛选Cry2Ab毒素受体表位的方法

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应用昆虫学报 2012年第5期49卷 1397-1405页

作者：齐佳刘晨曦吴孔明中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)产生的内毒素具有杀虫活性,Cry2Ab毒素作为Bt棉花的杀虫活性蛋白,其在靶标昆虫体内的结合受体及作用位点尚不清楚,本研究采用噬菌体展示(phage display)的方法,经4轮的"吸附—洗脱—扩繁"筛选... 详细信息

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)产生的内毒素具有杀虫活性,Cry2Ab毒素作为Bt棉花的杀虫活性蛋白,其在靶标昆虫体内的结合受体及作用位点尚不清楚,本研究采用噬菌体展示(phage display)的方法,经4轮的"吸附—洗脱—扩繁"筛选,并对阳性克隆所携带的外源DNA片段进行序列测定后,得到2段能够与活化Cry2Ab毒素相互作用的多肽序列,通过酶联免疫结合试验(ELISA)进一步证明,这2段多肽序列与活化Cry2Ab毒素具有较高的亲和力和特异性,结果表明,利用该方法能够由噬菌体随机肽库中高效捕获亲和序列,筛选到与活化Cry2Ab毒素具有高亲和力的多肽,该序列可以模拟Cry2Ab毒素的受体表位,为进一步研究Cry2Ab毒素作用机制奠定了基础,并为今后田间抗性基因频率检测,以及毒素—受体作用机制研究工作提供更有力的技术支持。

关键词：噬菌体展示表位筛选 Cry2Ab

利用噬菌体展示技术筛选Cry2Ab毒素受体结合表位的研究

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利用噬菌体展示技术筛选Cry2Ab毒素受体结合表位的研究

作者：齐佳中国农业科学院

学位级别：硕士

利用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)杀虫基因发展的Bt作物已经成为防治多种害虫的新手段。转Bt-Cry1Ac抗虫棉花在我国通过有效控制棉铃虫的危害,可降低植棉成本和提高棉花的产量,但随着Bt-Cry1Ac棉花的大面积推广,棉铃虫... 详细信息

利用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)杀虫基因发展的Bt作物已经成为防治多种害虫的新手段。转Bt-Cry1Ac抗虫棉花在我国通过有效控制棉铃虫的危害,可降低植棉成本和提高棉花的产量,但随着Bt-Cry1Ac棉花的大面积推广,棉铃虫的抗性风险不断上升,严重威胁Bt棉花的持续利用。Cry2Ab毒素是新一代Bt棉花的主要杀虫成分,已有研究证明棉铃虫对Cry2Ab与Cry1Ac毒素没有交互抗性,因此可通过种植新一代Bt棉花治理对Cry1Ac棉花的抗性。但到目前为止,国内外对Cry2Ab在棉铃虫中肠内的受体结合蛋白种类和受体结合表位等尚不清楚。鉴于Cry2Ab毒素与昆虫中肠受体的结合是发挥作用的关键步骤,寻找棉铃虫中肠上皮细胞上的毒素结合蛋白和结合位点,对阐明Cry2Ab毒素作用机理,发展棉铃虫抗性治理技术有重要意义。本文应用噬菌体展示技术,对Cry2Ab毒素模拟表位进行了体外筛选,并验证了模拟肽序列的生物学功能。Cry2Ab毒素在活化并纯化后,经“吸附-洗脱-扩繁”的4轮生物淘选,并对阳性克隆所携带的外源DNA片段进行序列测定后,得到与活化Cry2Ab毒素具有高亲和力的模拟肽序列NQFPSGAVYEHS和ATNEFPNPLHAP。将这两段多肽与Cry2Ab毒素进行ELISA结合分析表明它们能与活化的Cry2Ab毒素进行特异性结合。通过Western-blot检测发现,加入的两段多肽序列,可以抑制活化Cry2Ab与棉铃虫中肠BBMV的结合。将两段模拟肽分别与毒素孵育后,饲喂初孵棉铃虫可显著降低Cry2Ab毒素对棉铃虫的致死和生长抑制作用。对活化Cry2Ab的Ligand-blot分析发现,毒素在棉铃虫中肠BBMV上存在42kDa和100kDa两个结合蛋白。上述实验表明,筛选到的模拟肽序列具有明显的生物学功能,其可能与Cry2Ab毒素在棉铃虫中肠内的受体结合位点具有相似的氨基酸序列或空间结构。Ligand-blot实验证明Cry2Ab毒素主要存在两种受体蛋白,其作用的发挥可能有赖于与这两种蛋白相关作用因子的调控。综上所述,噬菌体展示技术为研究Bt毒素作用机制提供了新的手段,对深入明确不同Bt毒素作用方式的差异和害虫对Bt毒素的抗性机理有重要价值。

关键词： Bt抗性噬菌体展示 Cry2Ab 表位筛选