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喉鳞状细胞癌血管抑素和内皮抑素mRNA的表达

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中国耳鼻咽喉头颈外科 2005年第4期12卷 239-241页

作者：孙亚男金德均李源李鹏哈尔滨医科大学第二临床医学院耳鼻咽喉科黑龙江哈尔滨150086 中山大学第三临床医学院耳鼻咽喉科广东广州510630

目的探讨血管抑素和内皮抑素基因在喉,鳞状细胞癌发展过程中的作用及意义。方法运用RT-PCR方法检测45例喉鳞状细胞癌组织及21例声带息肉中血管抑素和内皮抑素基因的表达,并观察它们的表达水平与喉鳞状细胞癌临床病理特征的关系。结果血... 详细信息

目的探讨血管抑素和内皮抑素基因在喉,鳞状细胞癌发展过程中的作用及意义。方法运用RT-PCR方法检测45例喉鳞状细胞癌组织及21例声带息肉中血管抑素和内皮抑素基因的表达,并观察它们的表达水平与喉鳞状细胞癌临床病理特征的关系。结果血管抑素和内皮抑素在喉癌组织中表达阳性率分别为71.1%和88.9%,高于声带息肉中的4.8%和14.3%。血管抑素的mRNA表达与喉癌的淋巴结转移及临床分期正相关(P0.05)。内皮抑素的mRNA表达与喉癌T分级、淋巴结转移及临床分期有关(P0.05)。结论血管抑素和内皮抑素在喉癌发展过程中具有重要意义,人工上调它们的表达将可能成为喉癌生物学治疗的有效方法。

关键词：喉鳞状细胞癌血管抑素 RT-PCR方法内皮抑素基因 mRNA表达淋巴结转移组织学分级临床病理特征声带息肉临床分期原发部位生物学治疗喉癌组织重要意义有效方法阳性率正相关

人血管抑素的分离纯化及对不同细胞体外增殖的影响

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郑州大学学报（医学版） 2003年第1期38卷 51-54页

作者：房伯俊李惠翔张云汉马长路杨吉龙谈立松中国医学科学院中国协和医科大学血液病研究所天津300000 郑州大学第一附属医院病理科郑州450052 上海第一肺科医院癌症研究室上海200433

目的:探讨人血管抑素(angiostatin)对不同细胞体外增殖的影响。方法:用亲和层析、分子筛技术及有限酶解法从人血浆组分Ⅲ中分离纯化得到人血管抑素(human angiostatin,以下简称angiostatin),采用MTT法分别分析an-giostatin作用24 h、48 ... 详细信息

目的:探讨人血管抑素(angiostatin)对不同细胞体外增殖的影响。方法:用亲和层析、分子筛技术及有限酶解法从人血浆组分Ⅲ中分离纯化得到人血管抑素(human angiostatin,以下简称angiostatin),采用MTT法分别分析an-giostatin作用24 h、48 h、72 h原代培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)、不同剂量angiostatin(20 nmol/L,40 nmol/L,80 nmol/L,160 nmol/L,320 nmol/L及640 nmol/L)作用下HUVEC和小鼠肺动脉内皮细胞(1H11)、angiostatin为160 nmol/L时其他细胞(7721、Hela、A431、A549、H128、K562、LLC、SL7、3T3)体外增殖的抑制率;透射电镜下观察angiostatin作用后1H11细胞形态的变化。结果:纯化的angiostatin能特异地抑制HUVEC细胞的体外增殖,且呈现一定的剂量和时间依赖性,HUVEC对angiostatin的敏感性高于1H11(P抑制内皮细胞的体外增殖,其作用机制之一是诱导内皮细胞凋亡。

关键词：血管抑素体外增殖内皮细胞细胞凋亡细胞增殖肿瘤血管生成休眠方法

生物羊膜移植联合丝裂霉素和血管抑素治疗复发性翼状胬肉

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国际眼科杂志 2009年第10期9卷 2001-2002页

作者：刘海俊余惠芳李维义翁永德中国人民解放军第四二一医院眼科中国广东省广州市510318

目的:观察生物羊膜移植联合丝裂霉素C和血管抑素(angiostatin,AS)治疗复发性翼状胬肉的临床疗效。方法:复发性翼状胬肉142例患者行手术切除后,应用0.2mg/mL丝裂霉素C局部烧灼3min,暴露巩膜区行生物羊膜移植,术后给予血管抑素溶液,点术... 详细信息

目的:观察生物羊膜移植联合丝裂霉素C和血管抑素(angiostatin,AS)治疗复发性翼状胬肉的临床疗效。方法:复发性翼状胬肉142例患者行手术切除后,应用0.2mg/mL丝裂霉素C局部烧灼3min,暴露巩膜区行生物羊膜移植,术后给予血管抑素溶液,点术眼,4次/d,治疗持续15d,随访12～18(平均14.6)mo,观察其复发率及愈合时间。结果:无复发,治愈率100%。角膜上皮愈合时间为6.3±0.52d。结论:羊膜移植联合丝裂霉素C和血管抑素治疗复发性翼状胬肉可显著降低术后复发率并促进角膜创面的修复。

关键词：翼状胬肉生物羊膜丝裂霉素C 血管抑素

p53和血管抑素基因共转染抑制SGC7901细胞生长的实验研究

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p53和血管抑素基因共转染抑制SGC7901细胞生长的实验研究

作者：陈祥锦福建医科大学

学位级别：硕士

目的观察以pVITRO2质粒为载体共转染野生型p53和血管抑素基因对人胃癌细胞系SGC7901生长的影响,探讨联合基因治疗胃癌的可能性。方法用脂质体转染法将pVITRO2-p53-AS转染人胃癌细胞系SGC7901。应用RT-PCR法检测转染后细胞目的基因的表达... 详细信息

目的观察以pVITRO2质粒为载体共转染野生型p53和血管抑素基因对人胃癌细胞系SGC7901生长的影响,探讨联合基因治疗胃癌的可能性。方法用脂质体转染法将pVITRO2-p53-AS转染人胃癌细胞系SGC7901。应用RT-PCR法检测转染后细胞目的基因的表达,通过细胞集落形成试验、MTT生长曲线、流式细胞仪检测细胞周期和Annexin V凋亡蛋白,观察p53和AS共转染后对SGC7901生长和凋亡的影响。采用统计软件包SPSS10.0进行统计分析。结果:1. RT-PCR结果证实p53和AS共转染后能在SGC7901细胞稳定表达。2.细胞集落形成实验显示:目的基因转染后,转染组细胞集落形成数均少于未转染组( P抑制高于单基因转染组(P抑制SGC7901细胞生长时具有协同作用。5、流式细胞仪检测转染细胞凋亡峰和Annexin V凋亡蛋白显示:在转染p53、AS和共转染p53-AS的细胞中,,均出现不同程度的凋亡峰,凋亡率高于转染空载体组,双基因共转染组高于单基因转染组(P抑制SGC7901细胞生长、共同促进细胞凋亡等作用,提示联合基因治疗恶性肿瘤优于单个基因。

关键词： p53 血管抑素基因治疗恶性肿瘤

妇科常见恶性肿瘤患者尿血管抑素、VEGF水平及其临床意义研究

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妇科常见恶性肿瘤患者尿血管抑素、VEGF水平及其临床意义研究

作者：李根霞郑州大学

学位级别：硕士

血管生成(angiogenesis)是决定原发实体瘤及其转移瘤快速生长及发展的关键因素。肿瘤的血管生成可能与血管生成促进因子及抑制因子的调节失衡有关，其中，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及血管抑素(angios... 详细信息

血管生成(angiogenesis)是决定原发实体瘤及其转移瘤快速生长及发展的关键因素。肿瘤的血管生成可能与血管生成促进因子及抑制因子的调节失衡有关，其中，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及血管抑素(angiostatin)分别是目前研究较多的、特异性的内源性血管生成促进因子和抑制因子。VEGF是一种分子量为34～46kDa的糖蛋白，体内可通过旁分泌方式作用于血管内皮细胞，促进新生血管形成。血管抑素是血浆纤维蛋白溶酶原的裂解片段，分子量38～45kDa，具有强烈抑制血管内皮细胞增殖、迁移及促进内皮细胞凋亡的活性。近年来发现某些肿瘤患者体液循环及尿液中可检测到血管生成相关因子，尤其是循环的血管生成抑制因子(circulating angiogenesis inhibitor)，对其诊断及预测肿瘤的价值受到许多研究者的重视。本研究采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定了32例妇科常见恶性肿瘤患者尿液中血管抑素及VEGF的水平，探讨其在妇科肿瘤诊断方面的价值。方法：郑州大学第三附属医院2002年5月-2003年2月收治的32例临床期别为Ⅰ-Ⅲ期的三种常见妇科恶性肿瘤患者组成恶性肿瘤组，其中宫颈浸润癌16例，子宫内膜癌9例，卵巢恶性肿瘤7例;选择31例良性妇科肿瘤患者为良性肿瘤组;选择25例21-67岁的健康妇女为正常组。采用赖氨酸-ELISA法测定正常组及良、恶性郑州大学(2003)研究生毕业论文妇科常见恶性肿瘤患者尿血管抑素、VEGF水平及其临床意义研究肿瘤组患者尿液中血管抑素，以病理诊断为金标准，根据尿血管抑素检测妇科恶性肿瘤的灵敏度及特异度确定合适吸光度值为界值(cut-off)。血管抑素水平用检测标本的吸光度与界值的比值(S/CO)表示，S/C0值>1判为阳性，s/CO值(1，判为阴性。用人尿vEGF ELISA试剂盒测定正常组及恶性妇科肿瘤组患者尿液中VEGF水平。数据用中位数及四分位数间距表示，统计分析应用SPSS 10.0软件，采用正态性检验、单因素方差分析、秩和检验及xZ检验。结果: 1.赖氨酸一ELISA法测定尿液中血管抑素水平用于诊断妇科常见恶性肿瘤的灵敏度为78%，特异度为68%;2.妇科恶性肿瘤组患者尿血管抑素水平(S/CO中位数=2.06)高于正常组及良性肿瘤组(s/CO中位数分别为0.70及0.80)，差异有统计学意义(P血管抑素水平差异无显著性(P>0.05)。 3.妇科恶性肿瘤组患者尿血管抑素阳性率(78%)明显高于正常组(犯%)和良性肿瘤组(35%)，差异有统计学意义(P血管抑素阳性率差异无显著性(P>0.05)。 4.妇科恶性肿瘤组患者尿VEGF水平略高于正常组(中位浓度分别为42.50pg/ml及31 .25 pg/ml)，但统计结果显示两组间尿vEGF水平差异无显著性(P>0.05)。结论: 1.赖氨酸一ELISA法测定尿液中血管抑素水平可能成为一项协助妇科常见肿瘤临床诊断及良恶性预测的指标;2.尿液中VEGF水平可能不是协助早期诊断妇科常见恶性肿瘤的合适指标;3.妇科恶性肿瘤患者尿液中血管抑素水平与远处转移瘤血管生成的关系及其对肿瘤抗血管生成治疗方面的指导价值还待进一步研究。

关键词：血管生成血管抑素血管内皮生长因子酶联免疫吸附测定法妇科肿瘤尿液

～（188）Re-血管抑素的制备和其生物活性及在小鼠体内生物学分布的研究

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～（188）Re-血管抑素的制备和其生物活性及在小鼠体内生物学分布...

作者：张晓慧第四军医大学

学位级别：硕士

血管抑素(Angiostatin, AS)是1994年O’Reilly等发现的能强烈抑制血管内皮细胞生长和血管新生的相对分子量为38kD的蛋白质。AS以肿瘤血管内皮细胞为靶细胞,能诱导肿瘤细胞凋亡,对多种肿瘤及其转移瘤的生长有抑制作用。利用放射性核素标... 详细信息

血管抑素(Angiostatin, AS)是1994年O’Reilly等发现的能强烈抑制血管内皮细胞生长和血管新生的相对分子量为38kD的蛋白质。AS以肿瘤血管内皮细胞为靶细胞,能诱导肿瘤细胞凋亡,对多种肿瘤及其转移瘤的生长有抑制作用。利用放射性核素标记AS可对多种肿瘤及其转移病灶进行显像的同时实施“受体介导的靶向双效治疗”。Re是目前最具应用前景的核素,具有非常优良的核物理性质:分别以79%和20%的几率发射最大能量为2.11Mev和1.97Mev的β射线,同时伴随有十分适于显像的155kev的γ射线,可以方便地进行标记药物的辐射剂量估计、生物体内分布等药代动力学的研究及疗效评价,并用于恶性肿瘤放射性核素显像及放射性内照射治疗。Re的半衰期16.9h,能方便的从W-Re淋洗柱得到无载体核素。本实验进行了Re标记AS方法的初步研究和标记物在小鼠体内的生物学分布,为Re-AS的进一步研究奠定了基础。目的: 探索用铼(Re)直接标记血管抑素(Angiostatin, AS)的方法,研究标记产物的体外稳定性及其生物活性,并观察其在小鼠体内的生物学分布,以探讨Re-AS在抗血管生成方面的应用价值。方法: 1.制备的AS经鉴定后,用氯化亚锡(SnCl)还原法进行标记,并用正交设计的方法筛选最佳标记条件。 2.对标记产物用纸层析法测标记率。新华1号层析纸为支持体,分别以9g/L生理盐水和乙醇:氨:水(2:1:5 v/v)为展开剂,检测溶液中不同成

关键词：血管抑素 188Re 放射性核素标记体内分布

蛋白激酶C-α在重组血管抑素抑制兔耳创面愈合中的作用

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蛋白激酶C-α在重组血管抑素抑制兔耳创面愈合中的作用

作者：潘丽兰州大学

学位级别：硕士

目的研究PKC-a在重组血管抑素（Recombinant Human Angiostatin, rh-AS）（K1-3）影响兔耳皮肤创面愈合和血管增生中的作用。方法构建兔耳腹侧皮肤创面愈合模型。创面分别给予PBS液（对照组）、rh-AS（K1-3）（rh-AS组）、PMA （PM... 详细信息

目的研究PKC-a在重组血管抑素（Recombinant Human Angiostatin, rh-AS）（K1-3）影响兔耳皮肤创面愈合和血管增生中的作用。方法构建兔耳腹侧皮肤创面愈合模型。创面分别给予PBS液（对照组）、rh-AS（K1-3）（rh-AS组）、PMA （PMA组）、Go6983（Go6983组）、rh-AS联合PMA （rh-AS+PMA组）和rh-AS联合Go6983（rh-AS+Go6983组）湿敷,每日1次,连续13-16天（上皮化）。分别于伤后3天、7天、11天,采集创面图像,用Image-Pro Plus6.0图像处理软件计算创面愈合率,并记录各组创面愈合时间。于伤后第3天、7天、11天、上皮化时切取创面标本,采用CD34免疫组化染色检测微血管密度变化,用免疫组化方法半定量检测各时间点创面组织中PKC-a表达情况。创面愈合时间、创面愈合率、微血管密度及PKC-a阳性细胞比例均采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法检验,若方差不齐则采用Kruskal-Wallis检验;P＜0.05表示差异有统计学意义。结果1rh-AS组和G66983组创面愈合时间长于对照组而PMA组创面愈合时间短于对照组（P＜0.05）;rh-AS组创面愈合时间长于rh-AS+PMA组,但较rh-AS+Go6983组缩短（P＜0.05）;PMA组创面愈合时间短于rh-AS+PMA组（P＜0.05）;G66983组创面愈合时间较rh-AS+Go6983组缩短（P＜0.05）。 2.伤后第3天各组间创面愈合率无差异（P＞0.05）。伤后第7天：rh-AS组、G66983组创面愈合率小于对照组,而PMA组则高于对照组（P＜0.05）;rh-AS组创面愈合率低于rh-AS+PMA组,而高于rh-AS+Go6983组（P＜0.05）;PMA组创面愈合率高于rh-AS+PMA组（P＜0.05）;G66983组创面愈合率高于rh-AS+Go6983组（P＜0.05）。伤后第11天：rh-AS组、G66983组创面愈合率低于对照组（P＜0.05）,PMA组高于对照组（P＜0.05）;rh-AS组创面愈合率高于rh-AS+Go6983组（P＜0.05）;PMA组创面愈合率高于rh-AS+PMA组（P＜0.05）;Go6983组创面愈合率高于rh-AS+Go6983组（P＜0.05）。 3.微血管密度测定：伤后3天、7天、11天各组创面比较,rh-AS组、G66983组、rh-AS+PMA组、rh-AS+Go6983组微血管密度小于对照组（P＜0.05）,PMA组血管增生显著高于对照组及其余各组（P＜0.05）。各组创面上皮化时,新生血管也随之退化：各组微血管密度下降,但PMA组微血管密度仍高于各组（P＜0.05）。 ***-α广泛表达于创面组织细胞,随创面愈合过程进展,各组PKC-α表达增强,阳性细胞（成纤维细胞、内皮细胞、表皮细胞）比例增加。同一时间点组间比较,rh-AS组PKC-α表达水平与对照组无差异（P＞0.05）,PMA组、rh-AS+PMA组各时间点PKC-α阳性细胞比例均高于对照组和rh-AS组,Go6983组、rh-AS+Go6983组低于对照组和rh-AS组（P＜0.05）。结论1.血管抑素抑制创面愈合过程中血管增生,延迟创面愈合。2. PKC-α不介导血管抑素对创面愈合及血管增生的抑制作用。3.蛋白激酶C活化剂PMA促进创面愈合,而抑制剂Go6983延迟创面愈合。

关键词：蛋白激酶C 血管抑素创面愈合血管增生

125I-血管抑素受体内化作用及其影响因素的研究

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125I-血管抑素受体内化作用及其影响因素的研究

作者：张王峰第四军医大学

学位级别：硕士

血管抑素(Angiostatin,AS)是O’Reilly等于1994年从Lewis肺癌小鼠血清和尿液中分离出的能够特异性抑制肿瘤血管内皮细胞增生的因子。AS是大分子物质纤溶酶原的一个片段,相对分子量为38KD。自从发现AS能强烈抑制血管内皮细胞生长和血管... 详细信息

血管抑素(Angiostatin,AS)是O’Reilly等于1994年从Lewis肺癌小鼠血清和尿液中分离出的能够特异性抑制肿瘤血管内皮细胞增生的因子。AS是大分子物质纤溶酶原的一个片段,相对分子量为38KD。自从发现AS能强烈抑制血管内皮细胞生长和血管的新生,其生物学效应和作用方式即引起了人们极大的关注。AS作用机制不十分明了,内化可谓一个热点,人们公认的受体大致为αⅤβ3、ATP合成酶及Angiomotin等。本研究以125I标记的AS为放射性配基,探讨ECV304细胞内化AS的能力以及125I-AS杀伤ECV304细胞的剂量效应关系,并探讨温度、时间及125I-AS浓度等因素对ECV304细胞内化AS的影响,为125I-AS作为AS受体阳性肿瘤的放射治疗药物提供实验依据。目的: 利用125I标记AS,研究标记产物125I-AS的体外稳定性及生物活性,探讨人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞内化AS的能力及125I-AS杀伤ECV304细胞的效应,并探讨温度、时间及125I-AS浓度等因素对ECV304细胞AS受体内化的影响。方法: 1、利用弹性蛋白酶有限水解法制备AS,水解产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定后,用Ch-T法进行标记,用纸层析法测标记率。 2、用Sephadex-G50柱对标记产物进行纯化,纯化产物分别加入牛血清白蛋白(BSA)、生理盐水及不同摩尔比的半胱氨酸(Cys)以观察其体外稳定性。并利用细胞生长抑制实验检测标记纯化产物的生物活性。 3、采用放射性配基结合分析法,以125I-AS为放射性配基,37℃条件下, AS受体阳性细胞ECV304与125I-AS共同保温不同时间后,分别检测细胞的受体内化率;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同剂量125I-AS、游离125I及AS对ECV304细胞作用24,48,72,96 h的杀伤作用。 4、于4℃、24℃及37℃条件下,固定浓度125I-AS与ECV304细胞共同保温不同时间后,分别检测细胞的受体内化率。 5、37℃条件下,不同浓度125I-AS与ECV304细胞共同保温不同时间后,分别检测细胞的受体内化率。结果: 1、蛋白水解产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,相对分子量为38KD, 125I-AS标记率可达85%。 2、125I-AS在生理盐水中1、4、24 h的解离率分别为2.3%、5.2%、8.0%,在10g/L BSA中1、4、24h的解离率分别为4.6%、9.1%、11.0%。在不同摩尔比Cys溶液中孵育,125I-AS存在不同程度的解离,摩尔比在5以下时,4 h的解离率不超过11%,表明标记产物在体外较稳定。分别用不同浓度125I-AS和AS作用于ECV304细胞,并以6-氨基己酸作为对照,发现125I-AS及AS对ECV304细胞增殖均有明显的抑制作用,且125I-AS的作用强于单纯的AS,表明125I-AS具有较强的生物活性。 3、37℃条件下温育,125I-AS与AS受体结合并迅速使受体发生内化。0.5h内,受体内化率、膜受体结合率及细胞总结合率均随时间的延长而增加,在0.5h时,受体内化率为(12.6±1.1)%,膜受体结合率为(19.1±2.2)%,细胞总结合率为(31.7±1.6)% (r=0.814, P抑制效应,细胞抑制率达(79.4±3.7)% (F=312.9013 ,P抑制作用,有较强的生物活性,标记产物在体外较稳定。125I-AS可在AS受体介导下内化进入并杀伤ECV304细胞,呈剂量-效应、时间-效应关系。ECV304细胞AS受体内化受温度、时间及125I-AS浓度等因素影响,呈温度-效应、时间-效应关系,随125I-AS浓度增加,内化率降低。

关键词： 125I 标记血管抑素生物活性受体内化细胞

131I-血管抑素联合PcDNA-sTRAIL在荷瘤裸鼠模型肿瘤靶向治疗的研究

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131I-血管抑素联合PcDNA-sTRAIL在荷瘤裸鼠模型肿瘤靶向治疗的研究

作者：张弦第四军医大学

学位级别：硕士

【目的】肿瘤血管生成与其生长、侵袭和转移密切相关，抑制血管生成、促进肿瘤细胞凋亡是目前抗肿瘤治疗研究的热点。临床常用能够显著抑制肿瘤血管增生的药物有血管抑素(AS，Angiostatin)、内皮抑素(Endostatin)等，血管抑素重组蛋白... 详细信息

【目的】肿瘤血管生成与其生长、侵袭和转移密切相关，抑制血管生成、促进肿瘤细胞凋亡是目前抗肿瘤治疗研究的热点。临床常用能够显著抑制肿瘤血管增生的药物有血管抑素(AS，Angiostatin)、内皮抑素(Endostatin)等，血管抑素重组蛋白现已经用于临床，但是由于生产费用高昂、治疗剂量大和需要长期给药治疗等不足，目前不能完全普及。临床研究表明，内皮抑素单独或联合应用具有低毒、低免疫原性和低耐药性的优点，但是有效性尚待考证。因此，寻找有效的联合应用血管生成抑制剂的肿瘤治疗方案是当今需要解决的难点问题。肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL，Tumor necrosis factorrelated apoptosis ligand)是目前研究发现能明显促进肿瘤细胞凋亡的TNF家族成员。我们假设在肿瘤临床治疗中，如果有效的将抑制肿瘤血管生成、促进肿瘤细胞凋亡和肿瘤内照射的放射疗法相结合进行肿瘤靶向治疗，可能成为当今的一种新型肿瘤治疗方案。本研究通过构建PcDNA3.1-sTRAIL重组表达载体，对其进行扩增、纯化，采用放射性同位素I标记血管抑素(AS),在荷瘤裸鼠模型中进行PcDNA3.1-sTRAIL与I-AS联合抑瘤实验。【方法】 1．采用亲和层析法从人血浆中纯化得到纤溶酶原后用弹性蛋白酶进行有限消化得到血管抑素(AS)片段，采取Iodogen固相法将放射性核素I标记于AS，并测定I标记产物的标记率、比活度和体外稳定性。 2．采取Trizol一步法提取总RNA，以提取液作为模板，下游引物引导进行RT反应得到cDNA。然后以cDNA为模板，PCR一步法试剂盒进行扩增反应，获得目的DNA片段并纯化，采用凝胶电泳观察目的片段sTRAIL的长度，将扩增DNA片段与载体PUCm-T连接，构建T-sTRAIL质粒。将T-sTRAIL质粒转入感受态细菌TGI，用含有Amp抗性的LB培养基筛选阳性克隆。碱裂解法抽提质粒T-sTRAIL，鉴定无误后将PcDNA3.1和鉴定正确的T-sTRAIL质粒分别用EcoRI和BamHI双酶切并分离纯化后，用T4连接酶连接，将连接载体转入感受态细菌TGI，Amp抗性的LB培养基筛选阳性克隆。提取质粒并进行酶切并外送鉴定，保存鉴定正确的质粒和菌种。最后将PcDNA3.1-sTRAIL转染293T细胞并利用Western blot进行目标蛋白鉴定。 3．构建荷瘤裸鼠模型及SPECT显像培养A549细胞接种于裸鼠右前肢根部腹侧皮下，得到荷瘤裸鼠模型，尾静脉注射)I-AS0.2ml，3.7MBq，分别在2、12、24、48h进行SPECT显像。 4．联合抑瘤作用观察将32只荷瘤裸鼠随机分为4组，每组8只，实验前3天给予含10%碘化钾饮水进行甲状腺封闭，瘤内注射I-AS(含I11.1MBq，AS12.5mg/kg)加入浓度约为1μg/μl的PcDNA3.1-sTRAIL50μl+Lipofectin50μl、I-AS(含I11.1MBq，AS12.5mg/kg)、PcDNA3.1-sTRAIL50μl+Lipofectin50μl(浓度为1μg/μl)和生理盐水0.3mL，1次/周，连续四周，动态观察28天内肿瘤体积的变化并计算抑瘤率，采用游标卡尺测量肿瘤大小，肿瘤体积计算公式：V=W×L/2(W代表宽度，L代表长度)，同时通过HE染色观察肿瘤组织的形态变化。【结果】 1．L-LysineSepharose4B亲和层析法从人血浆中分离并纯化得到血管抑素(AS)。 Iodogen固相法得到的I-AS标记率为78.2%7.7%、比活度为1.31.95TBq/g，将获得产物于-20℃存放7天观察其稳定性，I-AS标记物放化纯度为原来的70.6%。结果显示Iodogen固相法所得标记物I-AS比活度高、性质稳定。 2．采用凝胶电泳观察目的片段sTRAIL的长度发现，与分子质量标记比较可见一条特异性条带大小为723bp左右，和预期大小相符，初步判定重组真核载体的构建成功。Westernblot鉴定结果得出蛋白与目的蛋白一致，大小为30.5kD，说明蛋白表达成功。 ***显像发现肿瘤区域放射性浓度较其他区域高，说明肿瘤区域可以特异性摄取血管抑素。 4．荷瘤小鼠模型在接受PcDNA-sTRAIL与I-AS联合治疗期间肿瘤平均体积与其他各组相比增长缓慢，肿瘤增长抑制明显。I-AS+TRAIL组抑瘤率结果较31I-AS组和TRAIL组分别提高了27%和45%。通过SPSS13.0统计学软件方差分析计算得到，在7、14、21、28天I-AS+TRAIL治疗组、I-AS组和TRAIL组移植瘤体积相对于生理盐水组均有非常显著差异(p＜0.01)。显微镜下观察移植瘤HE染色切片发现I-AS＋TRAIL组较I-AS组、TRAIL组和

关键词： PcDNA-sTRAIL 血管抑素放射性同位素碘肿瘤治疗方案细胞凋亡