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合成生物学 2023年第2期4卷 347-372页

作者：余茜刘建英程功清华大学医学院北京100084 深圳湾实验室广东深圳518132

蚊媒病毒可通过蚊虫叮咬在宿主和蚊虫媒介之间传播循环。由蚊媒传播的病毒达数百种之多,每年可造成数亿人感染,这些病毒感染可引起严重的人类疾病,如出血热、关节炎、脑炎和脑膜炎等,严重者可导致死亡。蚊媒病毒大部分为RNA病毒,其中黄... 详细信息

蚊媒病毒可通过蚊虫叮咬在宿主和蚊虫媒介之间传播循环。由蚊媒传播的病毒达数百种之多,每年可造成数亿人感染,这些病毒感染可引起严重的人类疾病,如出血热、关节炎、脑炎和脑膜炎等,严重者可导致死亡。蚊媒病毒大部分为RNA病毒,其中黄病毒科的蚊媒病毒流行最为广泛,包括登革病毒、寨卡病毒、黄热病毒、乙型脑炎病毒和西尼罗病毒等。目前虽然已有针对少数蚊媒黄病毒的有效疫苗,例如预防黄热病病毒和乙型脑炎病毒的疫苗,但仍然没有针对大多数蚊媒黄病毒的有效预防性疫苗和抗病毒疗法。因此,全面了解蚊媒黄病毒在脊椎动物宿主与蚊虫之间的感染与传播的机制,可能为抗蚊媒黄病毒的疫苗与药物研发提供新的思路与目标,从而使我们能够更有效地预测和控制蚊媒黄病毒在自然界传播和流行,为应对蚊媒黄病毒造成的公共卫生威胁提供新的解决方案。本文首先描述了蚊媒黄病毒的生物学特性和流行病学特性,接下来介绍了蚊媒黄病毒的传播途径与媒介模型,并进一步全面总结了目前对蚊媒黄病毒在宿主和媒介之间传播机制及病毒在蚊虫媒介中的感染机制的研究,同时针对蚊媒黄病毒的新型疫苗研发和药物筛选策略,对未来针对蚊媒黄病毒的机制研究与抗病毒策略开发进行了展望。

关键词：蚊媒黄病毒蚊虫媒介感染与传播致病机制疫苗与药物

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细胞融合病毒全基因序列分析与全长cDNA克隆的构建

细胞融合病毒全基因序列分析与全长cDNA克隆的构建

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作者：郝嘉男安徽医科大学

学位级别：硕士

细胞融合病毒(cell fusing agent virus,CFAV)是一种蚊媒病毒,与重要的人类病原登革病毒和黄热病毒同属于黄病毒科黄病毒属。与登革病毒和黄热病毒类似,细胞融合病毒的基因组也由编码区、5′非编码区(5′UTR)和3′(3′UTR)非编码区组成... 详细信息

细胞融合病毒(cell fusing agent virus,CFAV)是一种蚊媒病毒,与重要的人类病原登革病毒和黄热病毒同属于黄病毒科黄病毒属。与登革病毒和黄热病毒类似,细胞融合病毒的基因组也由编码区、5′非编码区(5′UTR)和3′(3′UTR)非编码区组成。编码区共编码十种蛋白,三种结构蛋白(C、pr M/M、E)和七种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。细胞融合病毒因能够引起白纹伊蚊细胞的融合现象而得名,这种病毒最初是在实验室培养的埃及伊蚊细胞中发现。随后,研究者从自然界蚊虫体内也分离到该病毒。基因组进化分析表明,细胞融合病毒与登革病毒、黄热病毒等黄病毒具有一定相似性。相比其他黄病毒,细胞融合病毒具有蚊虫特异性,不能感染脊椎动物,也不能在蚊细胞外的其他动物细胞内复制。研究发现,细胞融合病毒与登革病毒在自然界蚊子体内存在共感染现象。这种共感染对登革病毒的胞内复制与流行分布的影响目前尚不清楚。目前细胞融合病毒相关研究主要集中在病毒分离鉴定和进化分析,较少涉及其分子机制和生物学意义。这主要是因为缺少可以直接从基因层面操作该病毒的工具—反向遗传学系统,而构建反向遗传学系统的第一步是构建细胞融合病毒的全长c DNA克隆。反向遗传学是在获得生物体基因组全长序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰,如定点突变基因插入\缺失、基因置换,再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组,让其装配出具有生命活性的个体,从而研究生物体基因组的结构与功能。RNA病毒的反向遗传学,是采用病毒的遗传物质,在易感细胞中重新拯救出活病毒,一般是在细菌质粒中插入整个病毒基因组的c DNA拷贝,使得c DNA本身或从c DNA体外转录所得的RNA具有感染性。RNA病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因组序列,检测被拯救的人工改造病毒的表型,可以在体内有效地研究病毒基因结构、功能和病毒-宿主相互作用。目前反向遗传学技术已经十分成熟,许多RNA病毒的全长感染性克隆构建已经成功。成功构建细胞融合病毒的反向遗传系统可以直接对其基因进行操作,对于认识和深入改造病毒具有重要意义,进一步还可以此作为工具研究病毒特异性感染机制。本研究首先构建了23株黄病毒的系统进化树,明确了细胞融合病毒与其他黄病毒的进化关系,并且重点比较了细胞融合病毒与寨卡病毒,kamiti河病毒,朝阳病毒基因序列差异,同时对其结构蛋白和非结构蛋白进行了同源性比较。进一步我们分析Genbank上两株细胞融合病毒的基因序列,获得其保守序列后,设计了q RT-PCR的引物和探针,利用此引物和探针可以特异的、高效的检测到细胞融合的基因组,并且与寨卡病毒和乙脑病毒无交叉反应,为检测细胞融合病毒提供了有效的技术手段。之后通过体外全基因合成的手段获得细胞融合病毒的全序列DNA分片段,再通过体外连接的方法将其连接成完整的细胞融合病毒的全长c DNA,此研究为细胞融合病毒反向遗传学系统的构建提供了基础。本研究包括如下三个部分:一.细胞融合病毒全基因序列分析:通过Genbank数据库下载到3株细胞融合病毒序列,其中两株基因序列完全一致,本研究还挑选了其他21株黄病毒全基因序列与细胞融合病毒共同构建了系统进化树。通过分析对比确定了细胞融合病毒在黄病毒系统进化树种的位置,后分别比较了细胞融合病毒与寨卡病毒、Kamiti河病毒和朝阳病毒的C、pr M/M、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5蛋白基因序列和氨基酸序列。发现虽然细胞融合病毒在进化关系上与朝阳病毒接近,但是与寨卡病毒的基因同源性为41.2%,与朝阳病毒的基因同源性为40.7%。细胞融合病毒与寨卡病毒氨基酸序列同源性为25.4%,与朝阳病毒氨基酸序列同源性为25.5%。对细胞融合病毒非编码区的二级结构进行预测后发现细胞融合病毒Galveston株非编码区的5'-UTR长为103nt,其5'-UTR具有帽子结构,并且含有两个保守的茎环(stem loop,SL)结构SLA和SLB。细胞融合病毒Galveston株3'-UTR长为553nt,含有多个保守的线性序列及二级结构,分为A1、A2和A3三个结构域。通过与登革2型病毒的5'-UTR和3'-UTR结构对比,对细胞融合病毒二级结构的功能进行预测。二.细胞融合病毒毒检测方法的建立:细胞融合病毒最初是由Stollar和Thomas在实验室培养的埃及伊蚊细胞当中发现的,进一步分析表明,细胞融合病毒对白纹伊蚊细胞的感染可以引起后者发生细胞融合现象,且细胞融合病毒引起细胞融合的能力只有在白纹伊蚊细胞当中有效。我们分析NCBI上两株细胞融合病毒的基因序列,在其NS2A基因序列上获得其保守序列,设计了q RT-PCR的引物和探针。用包含细胞融合病毒NS2A

关键词：细胞融合病毒蚊媒黄病毒全长cDNA克隆

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寨卡嵌合疫苗的研发与应用

寨卡嵌合疫苗的研发与应用

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作者：李晓叶河南师范大学

学位级别：硕士

包括寨卡在内的虫媒病毒在森林循环野生动物宿主中传播,并外溢扩散到人群中,导致地方疾病流行。我们之前发现一种昆虫特异性黄病毒(Insect-specific flavivirus,ISFs)朝阳病毒(Chaoyang virus,CYV)在脊椎动物细胞中的复制存在缺陷,无法... 详细信息

包括寨卡在内的虫媒病毒在森林循环野生动物宿主中传播,并外溢扩散到人群中,导致地方疾病流行。我们之前发现一种昆虫特异性黄病毒(Insect-specific flavivirus,ISFs)朝阳病毒(Chaoyang virus,CYV)在脊椎动物细胞中的复制存在缺陷,无法感染脊椎动物。在这里,我们开发了一种嵌合病毒式的蚊媒疫苗,使用朝阳病毒作为载体,在病毒源头的野生动物宿主中控制寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)。将CYV的包膜蛋白(E)和膜蛋白(pr M)替换为ZIKV的pr M-E蛋白构建疫苗,命名为CYV-ZIKV。CYV-ZIKV在伊蚊中有效复制并传播到唾液,未观察到性传播或经卵巢传播。为了降低CYV-ZIKV在自然环境中传播的风险,对蚊子进行X射线照射,以确保100%不育,但不影响唾液中CYV-ZIKV的滴度。通过携带CYV-ZIKV病毒的蚊虫叮咬对小鼠进行免疫接种,可以引发较强并且持久的ZIKV特异性免疫反应,并对ZIKV的各型毒株提供完全保护。同时,免疫小鼠经蚊虫叮咬免疫后ZIKV的传播被阻断。通过携带CYV-ZIKV病毒的蚊虫叮咬免疫恒河猴,产生了中和抗体,达到了一定的免疫效果。因此,通过蚊虫叮咬免疫ISFs载体疫苗诱导ZIKV野生宿主群体免疫是可行的。本文的研究为开发蚊子携带疫苗以消除森林循环中的人畜共患病毒提供了一种未来的途径。

关键词：蚊媒黄病毒寨卡病毒嵌合疫苗昆虫特异性黄病毒

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