细胞融合病毒全基因序列分析与全长cDNA克隆的构建

作     者：郝嘉男 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：秦成峰

授予年度：2017年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：细胞融合病毒 蚊媒黄病毒 全长cDNA克隆 

摘      要：细胞融合病毒(cell fusing agent virus,CFAV)是一种蚊媒病毒,与重要的人类病原登革病毒和黄热病毒同属于黄病毒科黄病毒属。与登革病毒和黄热病毒类似,细胞融合病毒的基因组也由编码区、5′非编码区(5′UTR)和3′(3′UTR)非编码区组成。编码区共编码十种蛋白,三种结构蛋白(C、pr M/M、E)和七种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。细胞融合病毒因能够引起白纹伊蚊细胞的融合现象而得名,这种病毒最初是在实验室培养的埃及伊蚊细胞中发现。随后,研究者从自然界蚊虫体内也分离到该病毒。基因组进化分析表明,细胞融合病毒与登革病毒、黄热病毒等黄病毒具有一定相似性。相比其他黄病毒,细胞融合病毒具有蚊虫特异性,不能感染脊椎动物,也不能在蚊细胞外的其他动物细胞内复制。研究发现,细胞融合病毒与登革病毒在自然界蚊子体内存在共感染现象。这种共感染对登革病毒的胞内复制与流行分布的影响目前尚不清楚。目前细胞融合病毒相关研究主要集中在病毒分离鉴定和进化分析,较少涉及其分子机制和生物学意义。这主要是因为缺少可以直接从基因层面操作该病毒的工具—反向遗传学系统,而构建反向遗传学系统的第一步是构建细胞融合病毒的全长c DNA克隆。反向遗传学是在获得生物体基因组全长序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰,如定点突变基因插入\缺失、基因置换,再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组,让其装配出具有生命活性的个体,从而研究生物体基因组的结构与功能。RNA病毒的反向遗传学,是采用病毒的遗传物质,在易感细胞中重新拯救出活病毒,一般是在细菌质粒中插入整个病毒基因组的c DNA拷贝,使得c DNA本身或从c DNA体外转录所得的RNA具有感染性。RNA病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因组序列,检测被拯救的人工改造病毒的表型,可以在体内有效地研究病毒基因结构、功能和病毒-宿主相互作用。目前反向遗传学技术已经十分成熟,许多RNA病毒的全长感染性克隆构建已经成功。成功构建细胞融合病毒的反向遗传系统可以直接对其基因进行操作,对于认识和深入改造病毒具有重要意义,进一步还可以此作为工具研究病毒特异性感染机制。本研究首先构建了23株黄病毒的系统进化树,明确了细胞融合病毒与其他黄病毒的进化关系,并且重点比较了细胞融合病毒与寨卡病毒,kamiti河病毒,朝阳病毒基因序列差异,同时对其结构蛋白和非结构蛋白进行了同源性比较。进一步我们分析Genbank上两株细胞融合病毒的基因序列,获得其保守序列后,设计了q RT-PCR的引物和探针,利用此引物和探针可以特异的、高效的检测到细胞融合的基因组,并且与寨卡病毒和乙脑病毒无交叉反应,为检测细胞融合病毒提供了有效的技术手段。之后通过体外全基因合成的手段获得细胞融合病毒的全序列DNA分片段,再通过体外连接的方法将其连接成完整的细胞融合病毒的全长c DNA,此研究为细胞融合病毒反向遗传学系统的构建提供了基础。本研究包括如下三个部分:一.细胞融合病毒全基因序列分析:通过Genbank数据库下载到3株细胞融合病毒序列,其中两株基因序列完全一致,本研究还挑选了其他21株黄病毒全基因序列与细胞融合病毒共同构建了系统进化树。通过分析对比确定了细胞融合病毒在黄病毒系统进化树种的位置,后分别比较了细胞融合病毒与寨卡病毒、Kamiti河病毒和朝阳病毒的C、pr M/M、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5蛋白基因序列和氨基酸序列。发现虽然细胞融合病毒在进化关系上与朝阳病毒接近,但是与寨卡病毒的基因同源性为41.2%,与朝阳病毒的基因同源性为40.7%。细胞融合病毒与寨卡病毒氨基酸序列同源性为25.4%,与朝阳病毒氨基酸序列同源性为25.5%。对细胞融合病毒非编码区的二级结构进行预测后发现细胞融合病毒Galveston株非编码区的5 -UTR长为103nt,其5 -UTR具有帽子结构,并且含有两个保守的茎环(stem loop,SL)结构SLA和SLB。细胞融合病毒Galveston株3 -UTR长为553nt,含有多个保守的线性序列及二级结构,分为A1、A2和A3三个结构域。通过与登革2型病毒的5 -UTR和3 -UTR结构对比,对细胞融合病毒二级结构的功能进行预测。二.细胞融合病毒毒检测方法的建立:细胞融合病毒最初是由Stollar和Thomas在实验室培养的埃及伊蚊细胞当中发现的,进一步分析表明,细胞融合病毒对白纹伊蚊细胞的感染可以引起后者发生细胞融合现象,且细胞融合病毒引起细胞融合的能力只有在白纹伊蚊细胞当中有效。我们分析NCBI上两株细胞融合病毒的基因序列,在其NS2A基因序列上获得其保守序列,设计了q RT-PCR的引物和探针。用包含细胞融合病毒NS2A