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球孢白僵菌对葱蝇成虫血淋巴蛋白质及游离氨基酸的影响

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中国农业科学 2017年第3期50卷 591-598页

作者：张慧吴圣勇王晓青雷仲仁中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京市植物保护站

【目的】球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种重要的昆虫病原真菌,在毁灭性害虫葱蝇(Delia antiqua)的防治上具有重大潜力。研究旨在明确球孢白僵菌侵染葱蝇成虫后,血淋巴中蛋白质和游离氨基酸的变化及其致病的关系,揭示球孢白僵菌对... 详细信息

【目的】球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种重要的昆虫病原真菌,在毁灭性害虫葱蝇(Delia antiqua)的防治上具有重大潜力。研究旨在明确球孢白僵菌侵染葱蝇成虫后,血淋巴中蛋白质和游离氨基酸的变化及其致病的关系,揭示球孢白僵菌对葱蝇的生理调控机制。【方法】基于球孢白僵菌对葱蝇成虫的室内生物测定的研究基础,使用菌株GZGY-1-3,采用点滴法,用浓度为1×10~8个孢子/mL的孢子悬浮液处理葱蝇初羽化成虫,采用BCA法及高效液相色谱——串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定球孢白僵菌侵染不同时间(12、24、36、48、60和72 h)后,侵染组与对照组葱蝇成虫血淋巴中蛋白质总量及20种游离氨基酸含量;分析不同处理时间蛋白质和游离氨基酸总量和重要氨基酸的含量变化。【结果】球孢白僵菌侵染12—36 h,侵染组与对照组血淋巴蛋白浓度变化趋势相近,均呈先下降后小幅度上升趋势。但侵染组血淋巴中蛋白含量高于对照组,侵染24 h后,侵染组血淋巴内蛋白质是对照组的1.20倍;侵染48 h后,侵染组中蛋白含量下降到最低,仅为对照组的0.83倍。侵染60—72 h,血淋巴蛋白含量升高。葱蝇成虫血淋巴中共检测出20种游离氨基酸。侵染12—36 h,葱蝇成虫血淋巴中游离氨基酸总量下降;侵染36 h,游离氨基酸总量下降到最低,仅为对照组的0.63倍;侵染48—60 h,游离氨基酸总量持续上升;侵染60 h后,游离氨基酸总量上升到最高,为对照组的2.01倍;感染72 h,游离氨基酸总量下降。侵染后,血淋巴内游离氨基酸种类没有变化,各种游离氨基酸的含量波动差异较大。球孢白僵菌对血淋巴重要氨基酸的含量变化有显著影响。【结论】球孢白僵菌的侵染引起葱蝇成虫血淋巴中蛋白质和游离氨基酸的一系列变化,严重阻碍了葱蝇成虫的正常生理活动,在葱蝇生物防治中具有应用潜力。

关键词：葱蝇球孢白僵菌血淋巴蛋白质游离氨基酸

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葱蝇冬滞育蛹的全长cDNA文库的构建

昆虫知识 2010年第1期47卷 53-58页

作者：黎万顺冯国忠陈斌何正波昆虫与分子生物学研究所重庆高校生物活性物质工程研究中心重庆高校动物生物学重点实验室重庆400047

葱蝇Delia antiqua(Meigen)具有冬滞育的特性且与黑腹果蝇Drosophila melanogaster近缘。该研究目的在于构建葱蝇冬滞育蛹的全长cDNA文库,为进一步的冬滞育专化基因筛选、克隆、和表达分析奠定基础。利用RNAiso试剂盒提取葱蝇冬滞育蛹的... 详细信息

葱蝇Delia antiqua(Meigen)具有冬滞育的特性且与黑腹果蝇Drosophila melanogaster近缘。该研究目的在于构建葱蝇冬滞育蛹的全长cDNA文库,为进一步的冬滞育专化基因筛选、克隆、和表达分析奠定基础。利用RNAiso试剂盒提取葱蝇冬滞育蛹的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,经SfiⅠ酶切消化后,将cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB。经鉴定,原始文库的滴度为2.4×107cfu/mL。随机挑取15个克隆,经PCR快速鉴定,插入片段大小在0.5～3kb之间,平均大小在1kb左右,重组率达100%。结果表明该研究获得高质量的葱蝇冬滞育蛹cDNA文库。

关键词：葱蝇冬滞育蛹全长cDNA文库 SMART技术

葱蝇非滞育、冬滞育和夏滞育蛹发育和形态特征比较

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昆虫学报 2012年第7期55卷 816-824页

作者：黎万顺陈斌何正波重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所重庆市动物生物学重点实验室重庆401331

昆虫非滞育、冬滞育和夏滞育蛹具有不同的生理和发育过程。本研究以葱蝇Delia antiqua作为模式种,以黑腹果蝇Drosophila melanogaster蛹的发育形态特征和命名为参照,用解剖、拍照、长度测量和图像处理等方法系统地比较研究了非滞育、冬... 详细信息

昆虫非滞育、冬滞育和夏滞育蛹具有不同的生理和发育过程。本研究以葱蝇Delia antiqua作为模式种,以黑腹果蝇Drosophila melanogaster蛹的发育形态特征和命名为参照,用解剖、拍照、长度测量和图像处理等方法系统地比较研究了非滞育、冬滞育和夏滞育蛹的发育历期和形态变化,重点在头外翻和滞育相关发育和形态特征,目的在于弄清非滞育、冬滞育和夏滞育蛹发育和形态特征差异,为滞育发育阶段的识别、滞育分子机理研究奠定形态学基础。冬滞育蛹的滞育前期、滞育期和滞育后期分别为4,85和27d,夏滞育蛹的滞育前期、滞育期和滞育后期分别为2,8和22d。从化蛹至头外翻完成为滞育前期,头外翻完成约10h内复眼中央游离脂肪体可见。头外翻的完成是滞育发生的前提,非滞育、夏滞育和冬滞育蛹头外翻发生在化蛹后的48,36和83h,在头外翻过程中发育形态没有差异。头外翻的过程为:首先,头囊和胸部附肢从胸腔外翻,头部形态出现;然后,腹部肌肉继续收缩,将血淋巴和脂肪体推进头部及胸部附肢。葱蝇蛹在完成蛹期有效积温约15%时进入冬滞育或夏滞育。在滞育期,蛹的形态一直停留在复眼中央游离脂肪体可见这一形态时期,且冬滞育和夏滞育的蛹在形态上没有区别。在体长、体宽和体重上,冬滞育蛹最大,夏滞育蛹次之,非滞育蛹最小。在滞育后期,在黄色体出现期间,非滞育蛹的马氏管清楚可见,呈绿色,而滞育蛹的马氏管几乎不可见。本研究为认知昆虫滞育生理、从发育历期和形态上推断滞育发育进程提供了依据。

关键词：葱蝇滞育冬滞育夏滞育比较形态学发育历期有效积温

葱蝇热激蛋白DaHSP23基因的克隆及在冬滞育和夏滞育蛹中的表达分析（英文）

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昆虫学报 2016年第4期59卷 402-410页

作者：司风玲何正波陈斌重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所重庆400047

【目的】低分子量（12~43 k Da）热激蛋白（s HSPs）具有抗逆应答的功能,滞育是昆虫抵抗不良环境的特殊发育形式,但s HSPs在昆虫滞育发育过程中的作用仍不清楚。本研究克隆和特征化葱蝇Delia antiqua s HSP基因,并研究它在夏滞育和冬滞... 详细信息

【目的】低分子量（12~43 k Da）热激蛋白（s HSPs）具有抗逆应答的功能,滞育是昆虫抵抗不良环境的特殊发育形式,但s HSPs在昆虫滞育发育过程中的作用仍不清楚。本研究克隆和特征化葱蝇Delia antiqua s HSP基因,并研究它在夏滞育和冬滞育发育过程中的表达模式,为阐明s HSPs在滞育发育上的功能奠定基础。【方法】通过RACE-PCR方法克隆了葱蝇HSP23基因,通过相似性比较分析了其特征、结构域及与双翅目代表性同源基因的系统发育关系;采用实时荧光定量PCR研究了该基因在葱蝇冬滞育蛹和夏滞育蛹发育过程中的表达情况,通过表达的差异比较揭示了该基因与滞育发育的关系。【结果】克隆出了葱蝇HSP23基因,命名为Da HSP23（Gen Bank登录号：HQ392521.1）,其c DNA全长序列为904 bp,编码186个氨基酸,推测蛋白分子量为20.9 k Da,等电点为6.42。该基因的编码蛋白与其他双翅目昆虫的s HSPs有超过66%的氨基酸序列一致性,与已报道的其他双翅目昆虫的滞育相关HSP23基因同源。基因组测序显示该基因无内含子。Da HSP23基因在葱蝇非滞育蛹的发育过程中一直保持在较低的水平,各发育阶段间的表达量不存在显著差异。但在冬滞育和夏滞育蛹中,该基因从滞育起始期开始逐渐显著升高表达,到滞育维持期的中后期达到峰值,在滞育终止期逐渐降到较低的水平。【结论】Da HSP23基因在葱蝇冬滞育和夏滞育发育过程中明显上调表达,但存在差异,它在滞育期的调控可能是种专化的。Da HSP23可能在葱蝇两种类型的滞育上起重要作用。

关键词：葱蝇滞育热激蛋白基因克隆表达模式实时荧光定量PCR

葱蝇成虫防御类酶和血细胞对球孢白僵菌的防御作用

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中国生物防治学报 2017年第2期33卷 198-205页

作者：张慧吴圣勇王帅宇雷仲仁中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193 北京市植物保护站北京100029

测定了葱蝇成虫被球孢白僵菌侵染后,虫体超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarE)和乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性变化,并对侵染后血细胞的变化进行拍照观察。结果表明,虫体内SOD... 详细信息

测定了葱蝇成虫被球孢白僵菌侵染后,虫体超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarE)和乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性变化,并对侵染后血细胞的变化进行拍照观察。结果表明,虫体内SOD、CAT、POD、GSTs和AChE的比活力呈先上升后下降的趋势;处理组虫体内的Car E比活力和对照组的变化趋势相同,但始终低于对照组。侵染36~48 h后,大量的血细胞在菌丝体周围集结、包囊,阻碍和抑制菌丝的增殖。侵染54 h后,菌丝开始突破包囊块,在血淋巴中大量增殖,血细胞免疫被破坏。综上所述,球孢白僵菌侵染初期会触发葱蝇成虫的免疫系统,但由于菌丝的大量增殖,后期免疫系统崩溃,导致成虫死亡。为揭示球孢白僵菌的致病机理及葱蝇对真菌侵染的免疫防御提供理论依据。

关键词：葱蝇球孢白僵菌保护酶解毒酶细胞防御

葱蝇非滞育、夏滞育和冬滞育蛹体内抗氧化酶活性的比较分析（英文）

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昆虫学报 2018年第3期61卷 263-270页

作者：郝友进郭强陈斌重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所媒介昆虫重庆市重点实验室重庆401331

【目的】通过测定并比较分析抗氧化酶活性及谷胱甘肽氧化还原状态,探讨葱蝇Delia antiqua非滞育、夏滞育和冬滞育蛹体内抗氧化系统的差异。【方法】取葱蝇非滞育、夏滞育和冬滞育蛹,分别测定铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、锰超氧化物... 详细信息

【目的】通过测定并比较分析抗氧化酶活性及谷胱甘肽氧化还原状态,探讨葱蝇Delia antiqua非滞育、夏滞育和冬滞育蛹体内抗氧化系统的差异。【方法】取葱蝇非滞育、夏滞育和冬滞育蛹,分别测定铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性及还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化性还原型谷胱甘肽(GSSG)含量及GSH/GSSG比随发育时间的变化;并对各抗氧化因子进行了典型判别分析。【结果】5种抗氧化酶的活性在整个蛹期是动态变化的。与非滞育蛹和夏滞育蛹相比,处于滞育前期的冬滞育蛹具有较高的Cu/Zn-SOD酶活性,但处于夏滞育及冬滞育的维持期和滞育后期的滞育蛹体内Cu/Zn-SOD酶活性则明显低于同一发育时期的非滞育蛹。在整个蛹期,非滞育蛹体内Mn SOD酶活性显著高于夏滞育和冬滞育蛹,而在夏滞育和冬滞育蛹之间则无明显差异。比较两种酶活性则发现同一发育时期的Mn SOD平均酶活性明显高于Cu/Zn-SOD酶活性。在头外翻之前,滞育蛹体内CAT酶活性高于非滞育蛹,但处于滞育维持期和后期的蛹体内CAT酶活性则低于非滞育蛹。无论在非滞育蛹还是滞育蛹中,GPx和GR酶活性变化基本上呈相反的趋势。典型判别分析进一步表明葱蝇蛹体内的抗氧化系统具有发育时期和滞育类型特异性。【结论】非滞育蛹与夏滞育和冬滞育蛹体内的氧化还原状态存在明显差异。滞育前期和滞育后期的蛹体内较高的抗氧化酶活性和较低的GSH/GSSG比提示氧化状态的变化与高的呼吸速率及发育过程密切相关。

关键词：葱蝇滞育抗氧化酶氧化胁迫谷胱甘肽氧化还原循环

葱蝇非滞育与夏滞育蛹蛋白的双向凝胶电泳比较分析

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昆虫学报 2014年第2期57卷 161-167页

作者：郝友进胡文霞陈斌重庆师范大学生命科学学院昆虫与分子生物学研究所重庆401331

【目的】比较分析葱蝇Delia antiqua非滞育与夏滞育蛹的蛋白表达差异,为进一步揭示昆虫滞育的分子调控机理和昆虫防治提供理论基础。【方法】以非滞育和夏滞育的蛹为材料,提取总蛋白;进行双向凝胶电泳和凝胶图像分析,对并差异蛋白质进行... 详细信息

【目的】比较分析葱蝇Delia antiqua非滞育与夏滞育蛹的蛋白表达差异,为进一步揭示昆虫滞育的分子调控机理和昆虫防治提供理论基础。【方法】以非滞育和夏滞育的蛹为材料,提取总蛋白;进行双向凝胶电泳和凝胶图像分析,对并差异蛋白质进行MALDI-TOF MS质谱鉴定,获得该点的质量指纹图谱;利用MASCOT软件在NCBI和SWISS PORT蛋白质数据库中进行搜索鉴定。【结果】非滞育和夏滞育蛹的蛋白表达存在显著差异。通过质谱鉴定和生物信息学分析,13个差异表达的蛋白质分别为胶原蛋白、纺锤丝组装非正常蛋白6(SAS6)、5,10-亚甲基四氢叶酸合成酶(MTHFS)、Bnb蛋白(bangles and beads)及其他功能未知蛋白。【结论】葱蝇在夏滞育时期,蛹体内的某些蛋白被上调或下调表达。本研究所鉴定的蛋白中,部分可能是参与滞育相关的蛋白质网络中的成员,它们可能在抗高温、染色体分离、叶酸代谢等生理过程中发挥重要作用。

关键词：葱蝇滞育总蛋白双向凝胶电泳质谱分析生物信息学分析

葱蝇海藻糖-6-磷酸合成酶基因的克隆、序列分析及滞育相关表达

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昆虫学报 2013年第4期56卷 329-338页

作者：李源郝友进张玉娟司风玲陈斌重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所重庆市动物生物学重点实验室重庆401331

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是昆虫海藻糖合成途径中的关键酶之一。本研究通过对葱蝇Delia antiqua海藻糖-6-磷酸合成酶基因的克隆、序列分析及滞育相关表达的分析,旨在证明该基因在能源合成以及抵御高温... 详细信息

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是昆虫海藻糖合成途径中的关键酶之一。本研究通过对葱蝇Delia antiqua海藻糖-6-磷酸合成酶基因的克隆、序列分析及滞育相关表达的分析,旨在证明该基因在能源合成以及抵御高温和低温环境方面6发挥重要作用,为进一步弄清葱蝇滞育分子机制提供理论依据。根据葱蝇抑制消减杂交文库中的EST序列信息,设计特异性引物,并通过RACE技术克隆了葱蝇海藻糖-6-磷酸合成酶基因全长cDNA,命名为DaTPS1(GenBank登录号:JX681124),其全长为2904bp,开放阅读框2448bp,编码815个氨基酸,推测其相对分子质量为91.2kD,等电点为5.96。生物信息学分析表明,该基因编码的氨基酸序列具有两个保守结构域,与其他物种TPS具有较高的同源性,其中和黑腹果蝇Drosophila melanogaster亲缘关系最近,氨基酸序列一致性为92.1%;其蛋白质三维结构有15条大的α螺旋和11股反向平行的β链折叠。RT-PCR分析表明,DaTPS1在葱蝇非滞育、夏滞育和冬滞育期蛹中都有表达,但是非滞育期各时期表达量基本没有变化,而在夏滞育和冬滞育蛹的滞育前期表达量较高,滞育保持期表达量较低,滞育期后期表达量又有所升高。推断在葱蝇蛹夏滞育和冬滞育期前期,TPS1开始催化合成较多的海藻糖以提高滞育期抵御不良环境的能力,滞育保持期蛹的新陈代谢降低,所需能量较少,所以TPS1处于低水平表达状态,而滞育期结束后,蛹生长发育逐渐恢复,所需能量有所增加,TPS1的表达量再次升高。本研究对揭示昆虫TPS在能量代谢通路中的作用及昆虫滞育的分子机理具有一定的科学意义。

关键词：葱蝇滞育海藻糖-6-磷酸合成酶克隆序列分析半定量RT-PCR

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葱蝇过氧化氢酶基因的克隆及生物信息学分析

西南大学学报（自然科学版） 2014年第1期36卷 32-40页

作者：胡甘雨司风玲车燕飞张玉娟陈斌重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所重庆市动物生物学重点实验室重庆401331

过氧化氢酶(catalase,CAT)对昆虫的生长发育和代谢活动具有重要意义,是昆虫清除H2O2的关键酶.昆虫在滞育期间代谢速率很低,而CAT的活力与代谢强度有关,因此滞育期的昆虫是研究该酶的良好材料.本研究基于葱蝇转录组unigene序列信息,设计... 详细信息

过氧化氢酶(catalase,CAT)对昆虫的生长发育和代谢活动具有重要意义,是昆虫清除H2O2的关键酶.昆虫在滞育期间代谢速率很低,而CAT的活力与代谢强度有关,因此滞育期的昆虫是研究该酶的良好材料.本研究基于葱蝇转录组unigene序列信息,设计特异性引物并首次通过PCR技术克隆了葱蝇过氧化氢酶基因全长cDNA,命名为DaCAT,其全长为2 073bp,开放阅读框1 518bp,编码505个氨基酸,推测其相对分子质量为5.68×104,等电点为7.72.该研究对其进行了生物信息学分析并建立了系统发育树,分析表明该基因编码的氨基酸序列具有2个保守结构域及多个酶活性位点,与其他物种CAT具有较高的同源性,其中和拟果蝇Drosophila simulans亲缘关系最近,相似率为89.3%,采用SWISS-MODEL对其进行了蛋白质同源建模及3D结构预测分析,为进一步研究DaCAT基因在葱蝇滞育期间的代谢表达、酶活力测定以及具体功能奠定了基础.

关键词：葱蝇过氧化氢酶克隆生物信息学分析