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苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1518的插入突变体库的构建及芽胞萌发突变株的筛选

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华中农业大学学报 2010年第5期29卷 577-581页

作者：巫益鸣阮丽芳彭东海刘国强孙明华中农业大学生命科学技术学院/农业微生物学国家重点实验室武汉430070

通过携带Mini-Tn10转座子的温度敏感性质粒载体pIC333构建了苏云金芽胞杆菌YBT-1518菌株的插入突变体库。从突变体库中筛选得到1株芽胞不能在萌发剂L-丙氨酸诱导下萌发的突变株(命名为MA1),进一步的试验表明该突变株菌株的芽胞在其他氨... 详细信息

通过携带Mini-Tn10转座子的温度敏感性质粒载体pIC333构建了苏云金芽胞杆菌YBT-1518菌株的插入突变体库。从突变体库中筛选得到1株芽胞不能在萌发剂L-丙氨酸诱导下萌发的突变株(命名为MA1),进一步的试验表明该突变株菌株的芽胞在其他氨基酸L-苯丙氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸以及糖类萌发剂葡萄糖、果糖和蔗糖的诱导下也都不能萌发,表明MA1很可能属于新型的芽胞萌发缺陷突变株。

关键词：苏云金芽胞杆菌转座子突变体库 L-丙氨酸芽胞萌发

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Bt芽胞萌发特性及萌发基因功能的研究

Bt芽胞萌发特性及萌发基因功能的研究

作者：吴艳艳东北农业大学

学位级别：硕士

蜡样芽胞杆菌族中有三种研究较广泛的细菌，炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis，Ba)和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus，Bc)均具有致病性，在芽胞萌发后分别产生炭疽热毒素和致人患呕吐腹泻综合症的毒素，威胁着人类的健康与生命安全;苏云... 详细信息

蜡样芽胞杆菌族中有三种研究较广泛的细菌，炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis，Ba)和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus，Bc)均具有致病性，在芽胞萌发后分别产生炭疽热毒素和致人患呕吐腹泻综合症的毒素，威胁着人类的健康与生命安全;苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的芽胞对杀虫晶体蛋白的毒力具有增效作用，芽胞的萌发可能是增效作用所必需的。本实验对Bt芽胞萌发特性及质粒pHT73在营养萌发途径中的作用进行了初步的研究。通过分析YBt1520全基因组序列中芽胞相关基因，发现了一个与已知营养萌发基因不同的基因，功能未知，定名为gerZ，进一步研究了gerZ操纵子在营养萌发途径中的作用。优化了Bt芽胞萌发的条件。在不同萌发液、萌发液酸碱度、萌发温度以及不同浓度的萌发剂中，对Bt芽胞在30min内的萌发率进行了比较，确定萌发液为NaHPO(10mM)和NaCl(100mM)的混合物、PH值为7.2、萌发剂为肌苷(1mM)或L-丙氨酸(1mM)与各种氨基酸(100mM，除酪氨酸和色氨酸为1mM)组成的混合物，并且芽胞的萌发温度为37℃。利用上述体系，通过对Bt HD73出发菌株与无晶体突变株(缺失质粒pHT73)的芽胞在利用20种标准氨基酸(100mM)与L-丙氨酸(1mM)或者肌苷(1mM)萌发时的特性进行比较，得知在肌苷(1mM)与天冬氨酸(100mM)及肌苷(1mM)与谷氨酸(100mM)两条萌发途径中，无晶体突变株的芽胞萌发率是出发菌株的2倍左右，说明质粒pHT73含有负调控上述两条途径的芽胞萌发基因。对HD-73菌株中gerZ操纵子进行的序列测定，序列分析表明gerZ操纵子由gerZA、gerZB和gerZC三个顺反子构成。根据三者跨膜区的比较得知它们的复合物在与营养萌发剂相互作用时，GerZB的作用可能是锚定在膜上。利用基因敲除技术，获得了gerZ缺失突变株，对出发菌株与gerZ缺失突变株的营养萌发途径进行了比较，得知gerZ操纵子影响亮氨酸(100mM)、缬氨酸(100mM)、色氨酸(1mM)、苏氨酸(100mM)、半胱氨酸(100mM)和异亮氨酸(100mM)与L-丙氨酸(1mM)的混合物对应的萌发途径，即阻断gerZ操纵子后上述六条途径的萌发能力减半，说明gerZ操纵子与上述六条营养萌发途径相关。

关键词：苏云金芽胞杆菌芽胞萌发营养萌发萌发条件质粒pHT73 gerZ

苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1518插入突变体库的构建及芽胞萌发相关基因的初步研究

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苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1518插入突变体库的构建及芽胞萌发相关基...

作者：巫益鸣华中农业大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌因其杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的杀虫微生物,与其它芽胞杆菌相比,一个显著特点就是在形成芽胞的同时还能产生具有杀虫活性的晶体蛋白。芽胞在外界条件适宜的情况下又能萌发并形成营养体,其中的一... 详细信息

苏云金芽胞杆菌因其杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的杀虫微生物,与其它芽胞杆菌相比,一个显著特点就是在形成芽胞的同时还能产生具有杀虫活性的晶体蛋白。芽胞在外界条件适宜的情况下又能萌发并形成营养体,其中的一些相关机制的研究虽然取得了长足的进步,但仍然有诸多未知的领域有待研究,苏云金芽胞杆菌的芽胞萌发及其相关机制方面的研究报道则更少。本研究利用携带Mini-Tn10转座子的温度敏感型质粒pIC333构建了苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1518的随机插入突变体库,寻找和鉴定与芽胞萌发相关的一些基因。通过芽胞萌发实验初筛,以及相差显微镜观察和OD600nm检测的复筛,筛选到一株在萌发剂L-丙氨酸诱导下芽胞不萌发的突变株,命名为MA1。进一步研究表明突变株MA1在其他萌发剂(氨基酸以及糖类物质)的诱导下都不表现出萌发的表型。测序获得了转座子Mini-Tn10插入位点侧翼的核苷酸序列长度达6,250 bp,通过NCBI的序列比对分析,确定转座子Mini-Tn10插入基因的表达产物为葡萄糖酸盐透性酶(gluconate permease,GntP),且插入位点位于gntP基因3’末端。GntP的主要功能是将Na,砷酸盐,亚锑酸盐,硫酸盐等离子透过生物膜,推测GntP可能是作为一种通道蛋白或是一种转运蛋白,使得一些离子或小分子物质跨过芽胞衣以及皮层到达芽胞内膜并与其上的萌发受体结合,激活与萌发相关酶的活性,如皮层裂解酶,使芽胞皮层及芽胞衣更具通透性,致使芽胞皮层部分水化,芽胞核心的DPA以及一些阳离子释放,起始芽胞的萌发。通过对实验室已有的YBT-1518基因组文库的筛选以及借助载体pHT304亚克隆文库的构建,筛选得到了包含有完整gntP基因的亚克隆子,命名为pBMBW1,并将pBMBW1转化突变株MA1,得到MA1的回复突变菌株BMBW1,并观察其芽胞的萌发情况,结果显示芽胞萌发的表型并未得到回复,故推测转座子Mini-Tn10的插入突变不仅影响了gntP基因自身的功能,也影响了其侧翼基因(很可能是以操纵子的形式存在)的功能。

关键词：苏云金芽胞杆菌 Mini-Tn10 突变 L-丙氨酸芽胞萌发 GntP

艰难类梭菌芽胞形成和萌发相关调控的研究进展

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微生物学通报 2021年第4期48卷 1314-1322页

作者：王伟刚杨靖牛亚楠赵建宏河北医科大学第二医院河北石家庄050000 河北省临床检验中心河北石家庄050000

艰难类梭菌(Clostridioides difficile)是一种革兰氏阳性、可产毒素的专性厌氧菌,是引起抗生素相关性腹泻的主要致病菌。芽胞是造成艰难类梭菌传播和感染复发的重要因素,其形成和萌发在感染的发展过程中起到重要作用。近年来,越来越多... 详细信息

艰难类梭菌(Clostridioides difficile)是一种革兰氏阳性、可产毒素的专性厌氧菌,是引起抗生素相关性腹泻的主要致病菌。芽胞是造成艰难类梭菌传播和感染复发的重要因素,其形成和萌发在感染的发展过程中起到重要作用。近年来,越来越多的艰难类梭菌芽胞形成和萌发的具体机制被阐明。本文就近年来艰难类梭菌芽胞形成和萌发的相关分子调控机制的研究进展进行综述,以期为开发针对芽胞的有效治疗手段提供思路。

关键词：艰难类梭菌芽胞形成芽胞萌发调控机制

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单细胞分析研究二氧化氯对杀蚊细菌球形赖氨酸芽胞杆菌芽胞的影响

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中国生物防治学报 2022年第3期38卷 565-572页

作者：李翠梅王晓春张秀娟刘军贤王桂文广西师范大学物理科学与技术学院桂林541004 广西科学院南宁530007

球形赖氨酸芽胞杆菌Lysinibacillus sphaericus(Ls)是应用广泛的蚊虫生物防治制剂,在实际应用时可能会遇到不利的环境因子或杀菌剂。本研究通过单细胞分析方法监测ClO_(2)处理后的单个Ls芽胞及其萌发过程,探究ClO_(2)对Ls芽胞结构和成... 详细信息

球形赖氨酸芽胞杆菌Lysinibacillus sphaericus(Ls)是应用广泛的蚊虫生物防治制剂,在实际应用时可能会遇到不利的环境因子或杀菌剂。本研究通过单细胞分析方法监测ClO_(2)处理后的单个Ls芽胞及其萌发过程,探究ClO_(2)对Ls芽胞结构和成分的影响及与芽胞萌发相关蛋白的影响,以及ClO_(2)的杀胞机制。经0.05%~0.3%ClO_(2)处理5 min后,36%~86%的芽胞不能形成单菌落。吡啶二羧酸钙(CaDPA)特征峰(1017 cm^(-1))强度随处理程度增大有所降低,而蛋白质α-螺旋峰(1652 cm^(-1))强度没有明显变化。ClO_(2)处理显著改变Ls芽胞的萌发动态,芽胞启动CaDPA快速释放的时间、完全释放的时间以及皮层水解完成的时间显著延长;而外源CaDPA仅能触发低浓度ClO_(2)(0.05%)处理的芽胞,且显著迟缓。表明ClO_(2)处理没有直接破坏芽胞内膜但严重损伤了与萌发相关蛋白的功能,特别是皮层水解酶容易失活。这可能就是被处理的芽胞可以启动芽胞萌发的最初步骤,而不能进一步发展为营养细胞的原因。

关键词：球形赖氨酸芽胞杆菌二氧化氯拉曼光谱微分干涉差成像芽胞萌发单细胞分析

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调控苏云金芽胞杆菌毒力sRNA的鉴定和功能解析

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调控苏云金芽胞杆菌毒力sRNA的鉴定和功能解析

作者：袁茜木华中农业大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种可以合成多种对昆虫、螨虫和线虫等无脊椎动物具有杀虫活性的晶体蛋白以及一些小分子杀虫活性物质的芽胞杆菌,现已成为微生物制剂开发的主要来源之一。目前对其杀虫晶体蛋白的杀虫机制... 详细信息

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种可以合成多种对昆虫、螨虫和线虫等无脊椎动物具有杀虫活性的晶体蛋白以及一些小分子杀虫活性物质的芽胞杆菌,现已成为微生物制剂开发的主要来源之一。目前对其杀虫晶体蛋白的杀虫机制已经有很多报道,但关于Bt作为一种昆虫病原菌在杀虫过程中与宿主互作的方式还不是很清楚。本课题组前期发现了一些致病因子及其作用方式如Bel、Bmp1、Nep1等,同时还发现Bt中的sRNA参与其对宿主的毒力调控。本研从sRNA的角度出发系统性研究sRNA对Bt致病性的影响及其调控方式。通过sRNA的靶标预测、构建sRNA缺失突变体、表型检测和q PCR检测,解析了sRNA对Bt致病性的影响方式,得到了以下结果。1、从34个潜在与毒力相关的sRNA中鉴定出14个毒力相关的sRNA通过对菌株YBT-1518中确认转录的34个可能与毒力相关sRNA进行靶标预测,发现29个sRNA存在与Bt致病性相关靶标,利用CRISPR-Cas9技术构建了其中11个sRNA缺失突变体,并对该11个和实验室前期构建的11个sRNA缺失突变体进行毒力鉴定,发现14个影响YBT-1518致病性的sRNA,其中6个sRNA缺失突变体毒力上升。8个sRNA缺失突变体毒力下降。2、毒力相关sRNA影响菌株YBT-1518的生长、cry基因表达和芽胞萌发对影响YBT-1518毒力的sRNA缺失突变体进行Bt致病性过程的表型检测,发现其中1个毒力增强的sRNA(sRNA20)缺失突变体生长力增强,1个毒力减弱的sRNA(sRNA6)突变体生长力降低;2个毒力减弱的sRNA(sRNA6、sRNA7)缺失突变体在体内的芽胞萌发率下降,1个毒力增强的sRNA(sRNA20)缺失突变体在体外的芽胞萌发率上调。3、毒力相关sRNA4通过抑制潜在靶标基因YBT-1518-26670的表达削弱菌株YBT-1518毒力sRNA4的缺失会导致YBT-1518的毒力显著上升,并且sRNA4的靶标YBT-1518-26670在ΔsRNA4/YBT-1518中的表达量上调。通过GFP标签确认sRNA4可以负调控YBT-1518-26670的表达。同时YBT-1518-26670的超表达会导致YBT-1518的毒力显著上升。4、毒力相关sRNA13可以通过抑制潜在靶标基因xre的表达增强菌株YBT-1518毒力sRNA13的缺失会导致YBT-1518的毒力发生显著的上升,并且其靶标基因xre的表达量在肌苷和线虫提取液诱导的芽胞萌发过程中均发生明显的上调,同时xre的缺失会导致YBT-1518的毒力显著增强。5、毒力相关sRNA20可能通过潜在靶标基因ger KA抑制芽胞萌发从而影响Bt毒力sRNA20的缺失会导致YBT-1518的毒力显著上升,同时其靶标基因ger KA的表达量上调。而ΔsRNA20/YBT-1518在肌苷诱导的萌发过程中芽胞萌发率显著上升。6、毒力相关sRNA20抑制潜在靶标基因spoⅤAD的表达负调控菌株YBT-1518的芽胞形成本研究发现毒力相关sRNA中均存在芽胞形成相关的靶标基因,通过对sRNA缺失突变芽胞形成率的测定和相关靶标基因的检测,发现sRNA20可以负调控spoⅤAD的表达,并且ΔRNA20/YBT-1518的芽胞形成率也显著高于YBT-1518,并且spoⅤAD的超表达会导致YBT-1518的芽胞形成显著上调。本研究鉴定的毒力相关sRNA丰富了Bt的毒力调控因子,加深了人们对Bt作为一种病原菌的认识。sRNA对Bt致病性调控机制的解析,完善了Bt中sRNA对毒力的调控机制,为构建高毒力Bt菌株提供了一定的理论基础,有望促进Bt在农林害虫防治方面的应用。毒力相关sRNA对Bt芽胞形成的调控,为优化Bt芽胞形成表型,改善Bt制剂的工业生产提供了一定的思路。

关键词： sRNA Bt 芽胞萌发毒力假想蛋白 xre

炭疽芽胞杆菌A16R BA5641及lysA基因功能研究

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炭疽芽胞杆菌A16R BA5641及lysA基因功能研究

作者：高飞江南大学

学位级别：硕士

炭疽芽胞杆菌引起的炭疽病是五大人畜共患病之一，危害性极强，对世界各地的人类健康及畜牧业都构成了严重威胁。炭疽芽胞杆菌能导致皮肤炭疽、肺炭疽、肠道炭疽等疾病。炭疽芽胞杆菌还被用作生物战剂和制造生物恐怖，危害社会稳定。 ... 详细信息

炭疽芽胞杆菌引起的炭疽病是五大人畜共患病之一，危害性极强，对世界各地的人类健康及畜牧业都构成了严重威胁。炭疽芽胞杆菌能导致皮肤炭疽、肺炭疽、肠道炭疽等疾病。炭疽芽胞杆菌还被用作生物战剂和制造生物恐怖，危害社会稳定。本研究利用同源重组原理构建了A16R△BA5641::spc和A16R△lysA::spc菌株。测定了A16R及其突变株A16R△BA5641::spc和A16R△lysA::spc的生长曲线，比较了它们在糖代谢方面的差异;制备了A16R与突变株A16R△BA5641::spc的芽胞蛋白样品，完成其双向电泳图谱，比较了A16R与突变株A16R△BA5641::spc芽胞的差异蛋白，经取点、质谱鉴定得到了其差异蛋白的信息，之后又分析了差异蛋白;另外还比较了在诱导剂存在下两者芽胞萌发的情况。综上所述得出如下结果： 1．利用Cre-loxp系统成功构建了炭疽芽胞杆菌疫苗株A16R的突变株A16R△BA5641::spc和A16R△lysA::spc。 2．A16R及其突变株A16R△BA5641::spc、A16R△lysA::spc在糖代谢方面没有差别，但BA5641缺失株生长更好一些。 3．比较蛋白质组学分析A16R及其突变株A16R△BA5641::spc的差异蛋白，结果发现3个差异较大的蛋白，其中一个与蛋白质的合成有关，一个是过氧化氢酶，还有一个是蛋白折叠相关的分子伴侣。 4．基因BA5641在炭疽芽胞杆菌的四种萌发途径中都起到一定的作用，该基因的缺失导致芽胞萌发速率明显受到抑制。

关键词：炭疽芽胞杆菌 Cre/loxp系统 BA5641基因芽胞萌发双向电泳

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纳豆芽胞杆菌芽胞生物学性质的初步研究

纳豆芽胞杆菌芽胞生物学性质的初步研究

作者：蒋俊凯江西农业大学

学位级别：硕士

根据纳豆芽胞杆菌水解淀粉的生物学特性,从发酵床垫料中筛选分离出50株具有水解淀粉能力的菌株,再通过纤维蛋白复筛得到三株芽胞杆菌。最后,经生理生化试验确定菌株J22为纳豆芽胞杆菌。在较高温度下制备的纳豆芽胞杆菌芽胞要比低温时的... 详细信息

根据纳豆芽胞杆菌水解淀粉的生物学特性,从发酵床垫料中筛选分离出50株具有水解淀粉能力的菌株,再通过纤维蛋白复筛得到三株芽胞杆菌。最后,经生理生化试验确定菌株J22为纳豆芽胞杆菌。在较高温度下制备的纳豆芽胞杆菌芽胞要比低温时的芽胞对湿热抵抗力强。同样,芽胞对双氧水和甲醛的抗性也依温度变化而变化,但是对于紫外线辐射和干热的致死,不同温度下制备的芽胞的表现几乎是一致的。而对于渗透压抗性,芽胞的制备温度更高,它的抵抗力却越低。芽胞的制备温度影响了芽胞的很多性质,这其中自然包括多种外界压力。高水平的诱导一至两种受体的营养萌发剂诱导芽胞群体萌发后,仍然存在一部分芽胞保持休眠状态,这部分芽胞就称为超级休眠芽胞,分离的产量为4-12%。分离的超级休眠芽胞不仅在原始萌发剂下萌发率低,在其它种类的萌发剂中也同样如此,造成这种缺陷的原因并不是基因组的改变。但是,超级休眠芽胞却能在吡啶二羧酸钙中完全萌发。虽然它们在单一受体的萌发剂中不能萌发,但在能诱导多种受体的混合萌发剂中可以萌发。自然,用混合萌发剂中分离的超级休眠芽胞产量也低;用低浓度萌发剂分离的超级休眠芽胞产量有所提高,在低浓度萌发剂下的萌发率也很低,但在高浓度下却能萌发地很好。实验结果表明超级休眠芽胞占整个芽胞群体的数量依萌发条件不同而不同,萌发剂浓度越高,产量越低。也进一步说明,与大多数芽胞相比,超级休眠芽胞需要更多的信号来诱导其萌发。另一个可能影响产量的因素就是热激活,因为没有进行热激活处理过,超级休眠芽胞的产量要比经过了最适热激活处理的高。经最适温度热激活和缬氨酸诱导芽胞萌发,分离纯化后的纳豆超级休眠芽胞在初始萌发剂和互补萌发剂中的萌发率都不高。但是如果热激活温度比普通芽胞的最适温度高5—10℃话,超级休眠芽胞的萌发率能有明显的提高,尽管仍比普通芽胞的萌发率低。使用初始萌发剂和互补萌发剂的混合物能降低超级休眠芽胞和普通芽胞的最适热激活温度。与普通休眠芽胞相比,超级休眠芽胞对湿热的抵抗力也要更高。实验关于纳豆超级休眠胞的萌发、湿热抗性、和最适热激活温度有一些新的结果,并对超级休眠芽胞和普通休眠芽胞之间性质的差异进行了比较。

关键词：纳豆芽胞杆菌芽胞抗性芽胞萌发超级休眠芽胞热激活

苏云金芽胞杆菌Ⅱ型TA系统mazE/mazF在Bt侵染宿主过程的功能和机制研究

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苏云金芽胞杆菌Ⅱ型TA系统mazE/mazF在Bt侵染宿主过程的功能和机...

作者：李俐煦华中农业大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种广泛存在于自然界的革兰氏阳性菌,能够产生多种毒素以及致病因子,目前对Bt毒杀宿主的研究主要集中在主效毒素因子即杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,Cry)。有研究表明单独... 详细信息

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种广泛存在于自然界的革兰氏阳性菌,能够产生多种毒素以及致病因子,目前对Bt毒杀宿主的研究主要集中在主效毒素因子即杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,Cry)。有研究表明单独的Cry蛋白的杀虫活性低于Bt菌体和Cry蛋白的协同作用,因而Bt菌体在Bt毒杀宿主过程中的作用不可忽视。前期利用对昆虫高毒力的Bt菌株YBT-1520侵染家蚕,通过RNAseq测序获得侵染各个侵染阶段中Bt的转录组数据,从中发现一对Ⅱ型毒素抗毒素系统(TA系统)mazE/mazF迅速被激活,显示mazE/mazF可能参与了Bt与家蚕的互作。而目前对于mazE/mazF的研究主要集中在压力条件下如何被激活以及怎样帮助菌体度过不利环境;在病原菌和宿主互作方面仅发现mazE/mazF能够影响沙门氏杆菌等人类病原菌侵染小鼠的细胞和组织。而mazE/mazF如何调控病原菌适应宿主环境、完成定植并调控毒力方面的调控机理尚不清楚。本课题将研究Bt的mazE/mazF在Bt感染宿主过程中的作用和机制。1.Ⅱ型TA系统mazE/mazF在Bt侵染秀丽隐杆线虫时被激活本研究发现mazE/mazF在Bt侵染秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)初期的转录水平迅速提高至少4倍,随着侵染时期的推进mazE/mazF的转录保持高水平,表明其表达被激活并参与了Bt与线虫的互作。2.Ⅱ型TA系统mazE/mazF能够增强Bt在线虫体内的定植能力和毒力构建了Bt无晶体突变株BMB171的mazE/mazF缺失突变株和回复突变株,通过其与Cry蛋白复配使用对秀丽隐杆线虫以及家蚕生物活性测定,发现缺失突变株相对于野生型对秀丽隐杆线虫和家蚕的毒性分别下降80%和50%,而且突变株在线虫体内定植能力相对于野生型和回复突变株下降了80%,说明Ⅱ性TA系统mazE/mazF的缺失影响了Bt在秀丽隐杆线虫体内的定植能力,同时影响Bt对宿主毒力。3.Ⅱ型TA系统mazE/mazF能够促进芽胞皮层水解酶基因转录,提高Bt芽胞萌发率mazE/mazF的缺失降低Bt芽胞萌发率。本研究将野生型、突变株和回复突变株的芽胞与杀线虫晶体蛋白Cry5Ba复配作用秀丽隐杆线虫,测定Bt芽胞在线虫完成萌发到形成细菌袋的时间,发现突变株芽胞完成萌发以及杀死线虫到形成细菌带的时间延长9h,而且在体外条件和模拟体内萌发条件下突变株芽胞萌发能力相对于野生型和回复突变株菌下降约20%和10%。mazE/mazF的缺失导致芽胞萌发相关的芽胞皮层水解酶基因的转录水平下降,且该基因的缺失会导致芽胞萌发率下降。为了进一步研究mazE/mazF调控芽胞萌发的机制,通过q RT-PCR检测了与芽胞萌发相关的基因,例如芽胞萌发受体基因(BMB171＿20920,BMB171＿23575,BMB171＿23910),芽胞皮层水解酶基因(BMB171＿RS13555)等在野生型和突变株侵染线虫过程中的转录水平,发现芽胞皮层水解酶(BMB171＿RS13555)在突变株侵染线虫过程的转录水平下降。接着在BMB171中构建芽胞皮层溶解酶的缺失突变体,发现突变体芽胞在体外萌发和模拟体内萌发条件下萌发率相对于野生型下降约40%。Ⅱ型TA系统mazE/mazF发挥调控靶标功能的是MazF蛋白,MazF的化学本质是核酸内切酶,对下游直接作用靶标起到负调控作用。若mazE/mazF对芽胞萌发相关蛋白是直接调控作用,那么当mazE/mazF缺失后,理应促进芽胞萌发,而不是抑制芽胞萌发。推测MazF通过抑制负调控因子,促进芽胞皮层水解酶的转录,从而提高芽胞的萌发率。***作用的靶标分析生物信息学分析显示,BMB171的MazF(MazF-bmb171)与枯草芽胞杆菌中MazF(MazF-bs)有同源性。因此以MazF-bs的切割位点-UACAU-为预测依据,预测了MazF-bmb171的靶标并根据功能进行分类,主要涉及芽胞萌发相关基因,免疫逃逸,转录调控因子类,生长必需基因。在转录调控因子靶标中,Mur/Rpi R家族转录调控因子能够抑制N-乙酰胞壁酸的降解从而抑制芽胞水解酶的表达。因此MazF可能通过调控Mur/Rpi R家族转录调控因子影响芽胞萌发。结合以上数据和结果,可大致描绘Bt的Ⅱ型TA系统mazE/mazF在感染宿主中的作用方式,当Bt进入宿主体内后MazF抑制Mur/Rpi R家族转录调控因子,进而激活芽胞皮层水解酶,促进芽胞萌发,使Bt由休眠状态进入营养生长时期,促进Bt在宿主体内的定植,完成对宿主的侵染。通过对mazE/mazF在病原菌侵染宿主时的功能和调控机制的研究能更深入的了解Ⅱ型TA系统调控病原菌侵染宿主的机制

关键词：苏云金芽胞杆菌毒素-抗毒素系统秀丽隐杆线虫芽胞萌发芽胞皮层溶解酶