Bt芽胞萌发特性及萌发基因功能的研究

作     者：吴艳艳 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：高继国

授予年度：2007年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：苏云金芽胞杆菌 芽胞萌发 营养萌发 萌发条件 质粒pHT73 gerZ 

摘      要：蜡样芽胞杆菌族中有三种研究较广泛的细菌，炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis，Ba)和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus，Bc)均具有致病性，在芽胞萌发后分别产生炭疽热毒素和致人患呕吐腹泻综合症的毒素，威胁着人类的健康与生命安全;苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的芽胞对杀虫晶体蛋白的毒力具有增效作用，芽胞的萌发可能是增效作用所必需的。本实验对Bt芽胞萌发特性及质粒pHT73在营养萌发途径中的作用进行了初步的研究。通过分析YBt1520全基因组序列中芽胞相关基因，发现了一个与已知营养萌发基因不同的基因，功能未知，定名为gerZ，进一步研究了gerZ操纵子在营养萌发途径中的作用。 优化了Bt芽胞萌发的条件。在不同萌发液、萌发液酸碱度、萌发温度以及不同浓度的萌发剂中，对Bt芽胞在30min内的萌发率进行了比较，确定萌发液为NaHPO(10mM)和NaCl(100mM)的混合物、PH值为7.2、萌发剂为肌苷(1mM)或L-丙氨酸(1mM)与各种氨基酸(100mM，除酪氨酸和色氨酸为1mM)组成的混合物，并且芽胞的萌发温度为37℃。 利用上述体系，通过对Bt HD73出发菌株与无晶体突变株(缺失质粒pHT73)的芽胞在利用20种标准氨基酸(100mM)与L-丙氨酸(1mM)或者肌苷(1mM)萌发时的特性进行比较，得知在肌苷(1mM)与天冬氨酸(100mM)及肌苷(1mM)与谷氨酸(100mM)两条萌发途径中，无晶体突变株的芽胞萌发率是出发菌株的2倍左右，说明质粒pHT73含有负调控上述两条途径的芽胞萌发基因。 对HD-73菌株中gerZ操纵子进行的序列测定，序列分析表明gerZ操纵子由gerZA、gerZB和gerZC三个顺反子构成。根据三者跨膜区的比较得知它们的复合物在与营养萌发剂相互作用时，GerZB的作用可能是锚定在膜上。利用基因敲除技术，获得了gerZ缺失突变株，对出发菌株与gerZ缺失突变株的营养萌发途径进行了比较，得知gerZ操纵子影响亮氨酸(100mM)、缬氨酸(100mM)、色氨酸(1mM)、苏氨酸(100mM)、半胱氨酸(100mM)和异亮氨酸(100mM)与L-丙氨酸(1mM)的混合物对应的萌发途径，即阻断gerZ操纵子后上述六条途径的萌发能力减半，说明gerZ操纵子与上述六条营养萌发途径相关。