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嗜热四膜虫胱硫醚γ-裂解酶Cgl1的表达、定位及功能分析

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中国生物化学与分子生物学报 2019年第3期35卷 286-295页

作者：韩挺许静王伟化学生物学与分子工程教育部重点实验室山西大学生物技术研究所太原030006 山西大学生命科学学院太原030006

含硫氨基酸在不同的生物体中具有重要调节功能,转硫途径相关酶促进半胱氨酸的生成和硫化氢产生。本研究从嗜热四膜虫中鉴定一种胱硫醚γ-裂解酶(cystathionineγ-lyase 1,CGL1,TTHERM_00052400)基因。CGL1在营养生长期高水平表达,而在... 详细信息

含硫氨基酸在不同的生物体中具有重要调节功能,转硫途径相关酶促进半胱氨酸的生成和硫化氢产生。本研究从嗜热四膜虫中鉴定一种胱硫醚γ-裂解酶(cystathionineγ-lyase 1,CGL1,TTHERM_00052400)基因。CGL1在营养生长期高水平表达,而在饥饿阶段和有性生殖期,维持在较低的表达水平。通过密码子优化,人工合成CGL1基因,构建重组表达质粒pGEX-CGL1,转化大肠杆菌BL21(DE3)。***/pGEX-CGL1表达重组蛋白质GST-Cgl1,并通过亲和层析获得纯化。GST-Cgl1裂解胱硫醚产生半胱氨酸,也具有裂解半胱氨酸和同型半胱氨酸产生H_2S的活性。进一步构建重组质粒pNEO4-3HA-CGL1和pSMC1hpNEO-CGL1,转化四膜虫细胞,获得带有HA标签和干扰CGL1的突变体细胞株。免疫荧光定位表明,HA-Cgl1生长期定位在亲本大核,饥饿期定位在细胞质,有性生殖前期定位在亲本大核,而在后期定位在胞质中。CGL1干扰的突变体细胞株在有性生殖过程中不能形成合子核,发育中的小核异常降解,产生仅有大核的异常单细胞。结果表明,嗜热四膜虫含有进化中保守的胱硫醚γ-裂解酶Cgl1。Cgl1具有产生和裂解半胱氨酸的活性。Cgl1定位在细胞质和细胞核中,参与了有性生殖过程细胞核的发育。

关键词：嗜热四膜虫胱硫醚γ-裂解酶活性分析细胞定位

胱硫醚γ-裂解酶产生的内源性硫化氢对脂多糖诱导大鼠肝细胞凋亡的调节作用

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中国急救复苏与灾害医学杂志 2013年第5期8卷 431-436页

作者：李翠陈锋张永亮中国人民武装警察部队总医院放射科北京100039 中国人民武装警察部队后勤学院训练部

目的探讨内源性胱硫醚γ-裂解酶（CSE）/硫化氢（H2S）体系在脂多糖（LPS）诱导的肝细胞凋亡中的调节作用。方法培养大鼠正常肝细胞系BRL。实验随机分组为溶剂对照组、siRNA阴性对照组、CSEsiRNA组、LPS组、CSEsiRNA＋LPS组。设立时间点... 详细信息

目的探讨内源性胱硫醚γ-裂解酶（CSE）/硫化氢（H2S）体系在脂多糖（LPS）诱导的肝细胞凋亡中的调节作用。方法培养大鼠正常肝细胞系BRL。实验随机分组为溶剂对照组、siRNA阴性对照组、CSEsiRNA组、LPS组、CSEsiRNA＋LPS组。设立时间点为0h、4h、12h、24h；每组4个平行样。通过LPS孵育大鼠肝细胞系BRL不同时间，造成细胞损伤模型，以培养液上清中LDH活性反映细胞损伤程度。通过RT—PCR与Westernblot检测CSE基因、蛋白表达，用去蛋白法检测H2S生成情况；应用RNAi干扰技术，成功转染CSEsiRNA于肝细胞中，降低LPS引起的内源性H2S生成增多。通过荧光染色法检测BRL细胞线粒体膜电位（MMP）变化，通过Westernblot检测胞浆细胞色素c蛋白表达变化，应用流式细胞术检测BRL细胞凋亡率变化情况。结果LPS可显著提高CSE基因、蛋白的表达，并使H2S生成增多。同时也可使MMP降低并导致细胞凋亡率的增加。通过RNAi干扰技术，成功转染CSEsiRNA于肝细胞系BRL中，降低LPS引起的内源性H2S生成增多。与LPS单独作用BRL细胞相比，LPS作用转染后BRL细胞可导致MMP在短时间点降低，而在长时间点出现逐渐增加趋势；相应的细胞凋亡率则出现相反的趋势。结论在LPS诱导的细胞凋亡过程中，内源性CSE／H2S体系表现为早期抑制凋亡，晚期促进凋亡的特点。

关键词：胱硫醚γ-裂解酶硫化氢凋亡脂多糖 BRL细胞

高密度脂蛋白拮抗氧化型低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞中胱硫醚γ裂解酶表达的下调

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高密度脂蛋白拮抗氧化型低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞中胱硫...

作者：陈瑶琳福建医科大学

学位级别：硕士

目的:高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)拮抗氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)诱导的氧化应激在保护血管内皮细胞和平滑肌细胞中发挥重要作用。本实验探究了ox-LDL和HDL对血管平滑肌细胞(Vascula... 详细信息

目的:高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)拮抗氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)诱导的氧化应激在保护血管内皮细胞和平滑肌细胞中发挥重要作用。本实验探究了ox-LDL和HDL对血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)中气体信号分子硫化氢(Hydrogen sulfide,H2S)催化酶胱硫醚γ-裂解酶(Cystathionine gamma-lyase,CSE)表达的影响,以及HDL能否通过拮抗氧化应激来抑制ox-LDL对于CSE表达的调节作用及其中参与的机制。方法:大鼠主动脉血管平滑肌细胞在无菌环境下分离培养。从健康志愿者中提取的血浆经超速离心分离HDL和LDL,ox-LDL由硫酸铜(Cu SO4)氧化而得。CSE、血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)蛋白表达和ERK1/2、AKT、p38/MAPK的磷酸激活利用免疫印迹法检测,CSE m RNA表达用实时荧光定量PCR法测定。细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)释放用ROS介导的活性氧检测探针(DCFH-DA)检测。用亚甲基蓝显色测吸光度法测定H2S生成。RNAi技术沉默VSMC中HO-1的表达。结果:Ox-LDL能够呈时间和浓度依赖性地下调VSMC中CSE蛋白和m RNA表达。HDL不仅能直接促进VSMC中CSE蛋白表达和H2S释放,还能拮抗ox-LDL对CSE的下调作用。HDL能诱导HO-1生成并拮抗由ox-LDL诱导的胞内ROS释放。HDL诱导ERK、AKT、p38/MAPK磷酸化,ERK1/2、AKT、和p38/MAPK抑制剂能够减弱HDL诱导的HO-1表达并削弱对ox-LDL诱导的ROS释放的清除能力。ERK1/2、AKT、和p38/MAPK抑制剂能够削弱HDL诱导的CSE蛋白表达及HDL对ox-LDL诱导的CSE表达的拮抗作用。干扰VSMC中HO-1的表达,HDL对CSE表达的诱导作用减弱。结论:HDL能通过诱导HO-1表达拮抗ox-LDL诱导的VSMC中ROS释放和CSE表达下调,HDL还可直接诱导CSE蛋白表达和H2S的释放,且ERK1/2、AKT、p38MAPK信号通路参与其中。

关键词：高密度脂蛋白氧化型低密度脂蛋白胱硫醚γ-裂解酶血红素加氧酶-1

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胱硫醚γ-裂解酶抑制剂的筛选及其应用

胱硫醚γ-裂解酶抑制剂的筛选及其应用

作者：张洪苓山东大学

学位级别：硕士

硫化氢(H2S)被广泛认为是哺乳动物内源性信号气体传递器。研究表明,多种病理生理状态下会出现H2S浓度异常。2021年Science杂志发文称,由于细菌在抗生素氧化应激刺激下会代偿产生H2S,破坏细菌H2S介导的防御系统可以抑制细菌耐受性并清除... 详细信息

硫化氢(H2S)被广泛认为是哺乳动物内源性信号气体传递器。研究表明,多种病理生理状态下会出现H2S浓度异常。2021年Science杂志发文称,由于细菌在抗生素氧化应激刺激下会代偿产生H2S,破坏细菌H2S介导的防御系统可以抑制细菌耐受性并清除持留菌。因此,寻找抑制细菌H2S产生的化合物是遏制细菌耐药性产生的有益策略,该方法有望成为广谱抑菌方法;但是该策略需要被广泛实施及验证,并且需要发现大量选择性抑制细菌H2S产生的化合物并投入使用。胱硫醚γ-裂解酶(CSE)催化内源性H2S的生物合成,是在病理生理条件下调节H2S水平的潜在靶标。目前现有的CSE抑制剂多在高浓度下使用,对酶的选择性也不高,大多数hCSE抑制剂通过靶向辅酶磷酸吡哆醛(PLP)起作用,会干扰其他PLP酶的活性。因此,筛选新型、有效、特异性的CSE抑制剂具有重要的现实意义。本文主要研究以下三点内容:1、以虚拟筛选模型初步划定实验筛选范围,以新型荧光探针CSEP作为CSE底物构建荧光检测法,实时监测CSE的活性。结合酶动力学分析,设计优化了高通量筛选体系,经过初筛和复筛除去不抑制以及假阳性的化合物,得到CSE的六种阳性抑制化合物。2、对以上筛选的六种阳性化合物进行抑制效果的表征。经检测半抑制浓度IC50值、抑制类型及对 CSE 的选择性,得到 Tideglusib(IC50=4.455 μM)和 Ebselen(IC50=1.063μM)对CSE的抑制效果较好。鉴于Ebselen是具有多重功效的潜在活性药物,接下来对Ebselen及其它硒类化合物做了进一步的筛选及验证,得到二苯二硒(IC50=0.06743μM)对CSE的选择性较好相对于CBS,且二苯二硒竞争性的抑制CSE活性。3、基于荧光生物成像技术,验证筛选的二苯二硒(DiSe)和Tideglusib两个化合物对细胞中CSE和H2S的抑制效果。利用AzMC和CSEP两种荧光探针作对照实验,在共聚焦显微镜下通过观测细胞中平均荧光强度的变化,并反映活细胞中H2S及CSE水平。结果表明,DiSe和Tideglusib以剂量依赖的方式降低HCC-LM3细胞中内源性H2S水平及CSE水平。综上,本文将理论虚拟筛选和实验高通量筛选相结合,用于现实中胱硫醚γ-裂解酶(CSE)抑制剂的高效筛选,实现了筛选过程的简单化。以CSEP探针为基础,实验筛选出了适用于CSEP新型探针的高效CSE抑制剂,实现了调控-监测细胞中CSE浓度水平的高灵敏探测方法。该研究将为CSE和H2S抑制剂的筛选方法提供借鉴,且筛选得到的抑制剂结构将为CSE有效抑制剂的结构设计提供设计模板与思路。

关键词：硫化氢胱硫醚γ-裂解酶虚拟筛选高通量筛选抑制剂

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硫化氢与细胞的增殖和凋亡

生理学报 2007年第2期59卷 133-140页

作者：杨广东王睿 Lakehead大学医学研究中心

硫化氢是内源性气体分子家族中的一员,是一种气体递质(gasotransmitter)。近年来,内源性硫化氢的产生及生理意义已经被认识,其代谢异常与许多疾病有关。本文综述了最近发现的硫化氢对细胞增殖和凋亡的调节作用,并重点概述硫化氢细胞效... 详细信息

硫化氢是内源性气体分子家族中的一员,是一种气体递质(gasotransmitter)。近年来,内源性硫化氢的产生及生理意义已经被认识,其代谢异常与许多疾病有关。本文综述了最近发现的硫化氢对细胞增殖和凋亡的调节作用,并重点概述硫化氢细胞效应的分子机制,包括丝裂原活化蛋白激酶、细胞周期相关激酶、细胞死亡相关基因以及离子通道等的改变。对硫化氢调节细胞生长或死亡的深入了解将为新药设计及许多疾病的治疗提供新的思路。

关键词：硫化氢气体递质胱硫醚γ-裂解酶增殖凋亡

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双酶偶联法测定发酵液中L-高丝氨酸的含量

食品与发酵工业 2023年第2期49卷 239-245页

作者：赵金花魏亮徐宁马振平刘君天津科技大学生物工程学院天津300457 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308

L-高丝氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸,在食品、饲料、医药和化工等领域具有非常广泛的应用。近年来通过环境友好的微生物发酵法生产L-高丝氨酸受到广泛关注。在工业菌种迭代选育过程中存在大量的L-高丝氨酸发酵样品分析检测工作,但目... 详细信息

L-高丝氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸,在食品、饲料、医药和化工等领域具有非常广泛的应用。近年来通过环境友好的微生物发酵法生产L-高丝氨酸受到广泛关注。在工业菌种迭代选育过程中存在大量的L-高丝氨酸发酵样品分析检测工作,但目前关于L-高丝氨酸检测方法的报道仍然较少。该研究将胱硫醚γ-裂解酶和乳酸脱氢酶偶联催化,建立了一种简单快速的L-高丝氨酸检测方法。通过对检测体系中各组分进行系统优化,确定了反应体系中最佳试剂浓度为胱硫醚γ-裂解酶12 U/mL,乳酸脱氢酶50 U/mL,NADH 0.5 mmol/L,磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP)0.1 mmol/L,检测温度为40℃,pH为7.5。该方法检测灵敏,在L-高丝氨酸质量浓度为0.005~0.1 g/L时具有良好的线性关系,R 2达到0.9982,能够满足发酵液中L-高丝氨酸产量的测定,为L-高丝氨酸高产菌种的选育提供了重要技术支撑。

关键词： L-高丝氨酸发酵胱硫醚γ-裂解酶乳酸脱氢酶 NADH 高通量检测方法

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硫化氢在单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质纤维化中的水平变化及其干预影响

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中国当代儿科杂志 2013年第10期15卷 903-908页

作者：赵德安刘君黄倩韩子明新乡医学院第一附属医院儿内科河南卫辉453100 成都市妇女儿童中心医院肾内科四川成都610091 新乡医学院第三附属医院儿科河南新乡453003

目的本研究通过构建单侧输尿管梗阻(UUO)诱导肾小管间质纤维化(TIF)大鼠模型,观察硫化氢(H2S)在血浆中的水平变化及两种关键合成酶胱硫醚β-合酶(CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(CSE)在梗阻肾中的表达,并探讨H2S在TIF中的作用。方法构建UUO致TI... 详细信息

目的本研究通过构建单侧输尿管梗阻(UUO)诱导肾小管间质纤维化(TIF)大鼠模型,观察硫化氢(H2S)在血浆中的水平变化及两种关键合成酶胱硫醚β-合酶(CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(CSE)在梗阻肾中的表达,并探讨H2S在TIF中的作用。方法构建UUO致TIF大鼠模型,96只Sprague Dawley大鼠随机分为假手术组、模型组、NaHS低剂量治疗组(低剂量组)和NaHS高剂量治疗组(高剂量组),每组24只。治疗组分别于术后立即腹腔注射NaHS 1.4μmol/kg和7μmol/kg,每日两次;假手术组和模型组同时腹腔注射等量生理盐水。各组分别于术后7 d、14 d及21 d随机处死8只大鼠,采用去蛋白法测定血浆H2S含量;梗阻肾组织行苏木精-伊红及Masson染色,观察肾脏病理学变化;免疫组化方法检测梗阻肾组织CBS、CSE蛋白表达;RT-PCR法检测梗阻肾组织CBS mRNA、CSE mRNA的表达。结果 UUO大鼠肾小管间质损伤程度与血浆H2S浓度呈负相关(r=-0.891,P0.05)。结论 H2S参与UUO致肾小管间质纤维化的发展过程,而且CBS/H2S体系和CSE/H2S体系在TIF中发挥关键作用。外源性补充NaHS可以延缓TIF的进展。

关键词：输尿管梗阻肾小管间质纤维化硫化氢胱硫醚β-合酶胱硫醚γ-裂解酶大鼠

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硫化氢对糖尿病大鼠ED的影响和机制研究

中国病理生理杂志 2014年第1期30卷 139-143页

作者：毛玉山叶小磊麦一峰王少敏洪中立王黎明赵廷启王铁樵吕迪何文明宁波大学医学院附属医院内分泌科宁波市医学科学研究所药物与药理研究室宁波大学医学院附属医院心内科宁波大学医学院附属医院肿瘤内科浙江宁波315020

目的:观察硫化氢(H2S)对糖尿病(DM)大鼠勃起功能障碍(ED)的影响。方法:将70只SD雄性大鼠分为2组,60只腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立DM大鼠模型,10只注射生理盐水为正常对照。阿朴吗啡诱导勃起后检测DM造模成功大鼠的勃起功能情况,将存在E... 详细信息

目的:观察硫化氢(H2S)对糖尿病(DM)大鼠勃起功能障碍(ED)的影响。方法:将70只SD雄性大鼠分为2组,60只腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立DM大鼠模型,10只注射生理盐水为正常对照。阿朴吗啡诱导勃起后检测DM造模成功大鼠的勃起功能情况,将存在ED的36只大鼠随机分成3组:糖尿病对照组(DM组)、糖尿病+硫氢化钠组(DM+NaHS组)和糖尿病+西地那非组(DM+sildenafil组)。DM+NaHS组每天腹腔注射NaHS(50μmol/kg),DM+sildenafil组每天给予西地那非(5 mg/kg)灌胃,DM组每日腹腔注射生理盐水,注射体积为0.25 mL。持续饲养12周后,观察各组大鼠勃起功能情况,采集各组大鼠动脉血,测定血液中H2S含量及各组阴茎海绵体组织胱硫醚γ-裂解酶(cystathionineγ-lyase,CSE)活性及CSE表达水平。结果:STZ诱发的DM造模成功率为81.7%(49/60),DM大鼠发生ED的比例为73.5%(36/49),与DM组比,DM+NaHS组和DM+sidenafil组大鼠勃起功能良好,3个实验组大鼠勃起率分别为(33.3±5.5)%、(54.5±5.3)%和(63.6±9.1)%。与正常大鼠组比,各组DM大鼠阴茎海绵体中CSE活性与表达水平均有下降,其中DM+NaHS组大鼠的CSE活性及表达水平显著低于DM组(P<0.05)和DM+sildenafil组(P<0.05)。结论:STZ诱导的糖尿病大鼠中ED发生率较高,H2S对糖尿病合并ED大鼠勃起功能有一定的促进作用。外源性给予H2S可以反馈性抑制大鼠阴茎组织中CSE的活性和表达。

关键词：硫化氢糖尿病勃起功能障碍胱硫醚γ-裂解酶

硫化氢在ob/ob小鼠皮肤创面愈合中的作用与调控机制

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中国病理生理杂志 2016年第7期32卷 1167-1173页

作者：赵蕙琛柴家超郑杰王媛妹王园园郭秀芝管庆波刘元涛山东大学第二医院内分泌科山东济南250033 青岛市立医院内分泌科山东青岛266071 山东大学附属省立医院儿外科山东济南250021 山东大学第二医院心内科山东济南250033 山东大学第二医院肾内科山东济南250033 泰安市中心医院分院职二科山东泰安271000 山东大学附属省立医院内分泌科山东济南250021

目的:观察硫化氢(H2S)对ob/ob小鼠皮肤创面愈合的影响并探讨其作用机制。方法:将ob/ob小鼠随机分为生理盐水组、胰岛素组和NaHS(H2S供体)组,C57BL/6小鼠作为对照组,构建小鼠背部皮肤创面模型。干预后检测各组H2S释放量;用Western blot... 详细信息

目的:观察硫化氢(H2S)对ob/ob小鼠皮肤创面愈合的影响并探讨其作用机制。方法:将ob/ob小鼠随机分为生理盐水组、胰岛素组和NaHS(H2S供体)组,C57BL/6小鼠作为对照组,构建小鼠背部皮肤创面模型。干预后检测各组H2S释放量;用Western blot检测胱硫醚γ-裂解酶(CSE)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白的表达差异;用RT-qPCR检测CSE的mRNA表达变化;使用免疫组织化学法检测中性粒细胞及单核/巨噬细胞的浸润数量;使用ELISA检测肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6的水平;用Masson染色检测胶原沉积情况。结果:ob/ob小鼠皮肤创面肉芽组织中H2S释放及CSE蛋白、mRNA的表达水平以及胶原沉积显著低于C57BL/6小鼠(P<0.05)。外源性H2S可加速ob/ob小鼠皮肤创面愈合(P<0.05),增加胶原沉积。ob/ob小鼠创面中性粒细胞及单核/巨噬细胞浸润数量,TNF-α、IL-6的水平及MMP-9蛋白表达水平显著增加(P<0.05),NaHS组显著降低。结论:H2S可显著改善糖尿病难愈性溃疡的愈合,作用机制可能与其抗炎作用有关。

关键词：糖尿病创面愈合硫化氢胱硫醚γ-裂解酶抗炎作用