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重组猪干扰素的PEG修饰及其活性分析

重组猪干扰素的PEG修饰及其活性分析

作者：陈文毫重庆理工大学

学位级别：硕士

研究背景：干扰素是一类广谱抗病毒、影响细胞生长、调节细胞免疫等多功能蛋白质。干扰素在临床应用方面十分广泛，尤其针对病毒性疾病有很好的疗效。普通干扰素的缺陷在于体内半衰期短，难以持久地抑制病毒。使得长效干扰素的研发有着... 详细信息

研究背景：干扰素是一类广谱抗病毒、影响细胞生长、调节细胞免疫等多功能蛋白质。干扰素在临床应用方面十分广泛，尤其针对病毒性疾病有很好的疗效。普通干扰素的缺陷在于体内半衰期短，难以持久地抑制病毒。使得长效干扰素的研发有着重要的意义。人类干扰素的研究取得了长足的进步，聚乙二醇人干扰素已经实现了商品化，如佩乐能和派罗欣。而聚乙二醇化猪干扰素研究进展较为缓慢，目前国内尚没有相关药品上市和有效专利。研究目的：建立一种简便的制备聚乙二醇化重组猪干扰素方法，获得生物活性保留较好的单聚乙二醇干扰素。研究方法：在重组猪干扰素融合蛋白可溶性表达的基础上，使用EK酶将融合蛋白酶切，镍柱纯化后，制成干扰素原液。根据重组猪α干扰素的氨基酸序列特点，分别采用了相对分子质量为20kDa的直链型mPEG-ALD（单甲氧基聚乙二醇丙醛）和mPEG-SPA（单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯）修饰重组猪α干扰素。优化重组猪干扰素的聚乙二醇化条件，使用mPEG-ALD大量修饰rpoIFNα，采用SP阳离子交换层析法纯化单PEG修饰偶联物，SDS-PAGE检测修饰产物，运用细胞病变抑制法对其生物活性进行了初步研究。研究成果：（1）制备重组猪α干扰素的纯度在90%以上，达到初步实验研究的要求。（2）通过优化PEG修饰干扰素的条件，筛选出两种PEG修饰剂的最优修饰反应条件：①PEG-ALD修饰的最优条件：50mmol/L PB，pH=6.0、4℃、（PEG/protein）摩尔比为3：1，反应24h。②mPEG-SPA修饰的最优条件：50mmol/L PB中，pH=9.0、4℃、（PEG/protein）摩尔比为5:1，反应2h。（3）PEG-ALD对rpoIFNα的单修饰率达到60%以上，单聚乙二醇化干扰素的活性达到未修饰干扰素的2.9%。

关键词： α干扰素聚乙二醇修饰抗病毒药物基因工程药物猪干扰素

聚乙二醇化重组人生长激素长效作用及在体生物活性研究

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中国临床药理学与治疗学 2005年第11期10卷 1270-1274页

作者：李湛军杨化新徐康森中国药品生物制品检定所生化药品与基因工程药物室北京100050

目的:观察聚乙二醇化重组人生长激素(PEGGH)在去脑垂体大鼠体内的(invivo)促进生长的生物活性功能和长效药理作用。方法:以摘除脑垂体的大白鼠为动物模型,PEGGHd1一次给药;rhGH(国家标准品)作为阳性对照,每天给药一次,连续6d,使总剂量与... 详细信息

目的:观察聚乙二醇化重组人生长激素(PEGGH)在去脑垂体大鼠体内的(invivo)促进生长的生物活性功能和长效药理作用。方法:以摘除脑垂体的大白鼠为动物模型,PEGGHd1一次给药;rhGH(国家标准品)作为阳性对照,每天给药一次,连续6d,使总剂量与PEGGH一致。同时设模型组(去脑垂体大鼠),只给予0.1%牛血清白蛋白的生理盐水,d7处死大鼠,检测指标为:体重增加、尾长增长、胫骨骨骺板宽度和肝脏重量。结果:实验结果显示,与模型组比,PEGGH一次给药各剂量组体重显著增加(P0.05),具有长效的作用,其中4.3、8.6IU·kg-1所至生物活性大于多次给药的普通rhGH8.6IU·kg-1效果;本批供试品测得生物效价为5.0IU·mg-1,比普通rhGH高1倍。结论:本批供试品PEGGH用药次数少、药效持续时间长,比普通rhGH具有更高的促进动物机体生长的生物活性。

关键词：重组人生长激素聚乙二醇修饰长效生物活性在体的药效学

肌肉来源exosome作为药物载体在DMD基因治疗中的应用核糖体失活蛋白Gelonin在抗肿瘤方面的开发与研究

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肌肉来源exosome作为药物载体在DMD基因治疗中的应用核糖体失活蛋...

作者：张娅洁天津医科大学

学位级别：硕士

杜兴肌肉萎缩症(Duchenne Muscular Dystrophy,DMD),是一种由于X染色体上隐性基因突变导致肌肉细胞不能正常表达Dystrophin蛋白,进而引起的全身性肌肉萎缩疾病,全球大约每3500个男孩中就有一个罹患此疾病。目前,针对此类疾病研究最多的... 详细信息

杜兴肌肉萎缩症(Duchenne Muscular Dystrophy,DMD),是一种由于X染色体上隐性基因突变导致肌肉细胞不能正常表达Dystrophin蛋白,进而引起的全身性肌肉萎缩疾病,全球大约每3500个男孩中就有一个罹患此疾病。目前,针对此类疾病研究最多的治疗方法是基因治疗和细胞治疗。基因治疗中,虽然反义寡核苷酸(Antisense Oligonucleotides,AOs,如MOE、PMO、2’-OMe)介导外显子跳读已然显示出了种种优越性,但其仍存在靶向性差、药物运输效率低、生物利用率低、药物安全性不足等瓶颈。Exosome为细胞分泌的直径为45-120nm的囊状小泡,具有与细胞膜类似的磷脂双分子层结构。基于生物体自体来源的特性,exosome兼具低免疫原性、潜在靶向性、可穿过血脑屏障、易进入细胞等优点。因此,利用exosome作为载体递送基因治疗药物是解决AOs的递药问题的优选手段。本研究旨在通过对成肌细胞C2C12来源的exosomes的提纯和鉴定来获得理想的药物载体,将基因治疗药物AOs装载入成肌细胞来源的exosomes,从而提高基因治疗DMD的效率,达到治疗DMD的目的。利用透射电镜、激光共聚焦显微镜、Nanosight、流式细胞技术等分别对exosomes的粒径分布、特征生理途径、肌肉细胞系对exosomes的摄取能力等进行逐一研究和表征;尝试利用电击转染和两种物理手段进行药物的装载;采用RT-PCR、PCR等方法检验药物装载和治疗结果;胫骨前肌(Tibialis Anterior,TA)肌肉局部注射药物体系,通过免疫组化处理肌肉组织冷冻切片来探究药物在疾病模型鼠中的治疗效果。实验研究结果表明,利用过滤与超速离心相结合的方法所获得的成肌细胞C2C12来源的exosomes,具有粒径分布均一、入胞途径和胞内行为与文献报道相符、有肌肉细胞和组织的倾向性等特点。所获得的exosomes平均粒径大小在110nm左右,分布较为均一;透射电镜下可见杯状囊泡样双层膜结构,说明本文所述的提取方法可以保留exosomes的完整结构,方案可靠;利用激光共聚焦显微镜将其与早期内涵体、晚期内涵体分别进行荧光共定位,发现exosomes在早晚期内涵体中均有蓄积,说明所得到的exosome与文献报道中exosomes在细胞中的行为途径一致,从而进一步验证所获得的囊泡为exosomes;在不同肌肉细胞系对成肌细胞C2C12来源exosomes的摄取探究中发现,exosomes可以进入多种肌肉细胞。药物装载实验证实了exosomes可以作为AOs进入肌肉的运输载体,实验结果证明,利用物理方法对exosomes与AOs的混合物进行处理,装载后的exosomes可以在细胞水平介导外显子跳读;将载药exosomes局部注射到小鼠肌肉中发现,通过物理手段得到的载药exosomes表现出了一定的治疗作用。总之,成肌细胞C2C12来源的exosomes可以成为AOs的药物良载体。AOs可以介导外显子跳读,而生物自体来源的纳米囊泡exosomes作为一种新兴的生物药物载体正在受到越来越广泛的关注。在此,釆用一系列物理手段将以上两者结合,利用肌肉来源的exosomes运送AOs,通过其介导外显子跳读而生成半功能性膜骨架蛋白,从而的达到治疗杜兴肌肉萎缩症的目的。随着人类对生命科学的不断探究和生物医学工程技术的持续进步,以蛋白类药物为代表的生物大分子药物在抗肿瘤药物的研究中占有举足轻重的地位。相较阿霉素(Doxorubicin,DOX)、紫杉醇(Paclitaxel,PTX)等小分子化学药物,大分子抗肿瘤药物有着极高的生物活性。以核糖体失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein,RIP)为例,它是一类植物来源的酶类毒素,具有高效的细胞杀伤能力,一旦进入细胞后,能够在极低剂量的情况下高效阻断真核细胞中的蛋白质翻译过程,抑制细胞生长。Gelonin是一种29 kDa大小的核糖体失活蛋白,来源于大戟科植物(Gelonium multiflorum)种子,可以高效地抑制蛋白的合成。因此,核糖体失活蛋白Gelonin可以成为高效的肿瘤治疗生物药物。为了充分利用Gelonin的生物活性、增强其肿瘤杀伤效果、提高其生物利用度,本研究完成了两部分工作:1、将生物大分子蛋白药物Gelonin与小分子化学药物阿霉素联合用药,利用两种药物的协同作用杀灭肿瘤细胞,并且解决阿霉素在乳腺癌细胞中的耐药问题(人乳腺癌细胞系MCF-7/ADR);2、采用低分子量鱼精蛋白(Low Molecular Weight Protein,LMWP)和聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)对Gelonin进行定点修饰,以期增加其肿瘤杀伤效力和生物利

关键词： exosome 杜兴肌肉萎缩症药物载体反义寡核苷酸生物材料纳米粒 Gelonin 核糖体失活蛋白肿瘤治疗联合用药阿霉素穿膜肽聚乙二醇修饰

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姜黄素衍生物体外释放及抗肿瘤作用研究

中国现代应用药学 2013年第3期30卷 289-294页

作者：俞婷婷蒋福升刘楠楠丁志山浙江中医药大学杭州310053

目的研究姜黄素衍生物mPEG2k-Gly-Cur,mPEG2k-Gly-Cur-OA和Cur-OA2的体外释放情况及其体外抗肿瘤作用。方法采用高效液相色谱法,进行姜黄素衍生物在人肝癌细胞株HepG2培养上清液中水解释放特性的研究;采用MTT法对各姜黄素衍生物体外抗... 详细信息

目的研究姜黄素衍生物mPEG2k-Gly-Cur,mPEG2k-Gly-Cur-OA和Cur-OA2的体外释放情况及其体外抗肿瘤作用。方法采用高效液相色谱法,进行姜黄素衍生物在人肝癌细胞株HepG2培养上清液中水解释放特性的研究;采用MTT法对各姜黄素衍生物体外抗肿瘤细胞活性进行初步评价。结果建立了姜黄素的HPLC检测条件,在灭活的细胞培养上清液中,mPEG2k-Gly-Cur和mPEG2k-Gly-Cur-OA可以以相对合适的速度缓慢释放姜黄素,而Cur-OA2释放非常缓慢;但在未灭活处理的细胞培养上清液中姜黄素衍生物释放速度均明显加快,表明衍生物可以通过酶促反应加速释放。体外MTT实验证实3个姜黄素衍生物具有较好的抗肿瘤作用,而且Cur-OA2活性最强,但相对游离姜黄素均有所下降。结论姜黄素酚羟基经衍生化后可有效提高水溶液中稳定性,而油酸双酯化衍生物可能通过肝癌细胞吞噬作用增强药效,值得进一步深入的系统研究。

关键词：姜黄素衍生物体外释放抗肿瘤聚乙二醇修饰

鱼藤酮纳米脂质载体及其修饰物在大鼠体内的分布

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江苏大学学报（医学版） 2016年第4期26卷 346-351,366页

作者：李亚南毛全高如皋市人民医院药剂科江苏如皋226500

目的:探讨聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修饰后的鱼藤酮纳米脂质载体(rotenone loaded nanostructured lipid carriers,R-NLC)在大鼠体内的分布。方法:取SD大鼠123只,其中21只随机分为3组,每组7只,分别皮下注射鱼藤酮溶液、R-NLC、PEG修饰的鱼藤酮纳米脂质载体(PEG-R-NLC),在不同时间点取尾静脉血;其余102只SD大鼠随机分为17组,5组皮下注射鱼藤酮溶液,12组分别皮下注射R-NLC(6组)和PEG-R-NLC(6组),在不同时间点取各种组织;采用HPLC法检测血浆和组织样品中鱼藤酮的含量,观察并比较大鼠体内的分布。结果:鱼藤酮溶液在血液中达峰时间(Tmax)为4 h,在各组织分布的曲线下面积(AUC)由高到低依次为肾、肝、脑、脾、心、肺。R-NLC和PEGR-NLC在血液中的Tmax为8 h,AUC分别为鱼藤酮溶液35.99、42.03倍;R-NLC在各组织分布的AUC由高到低分别为脑、肝脏、肾、心、脾、肺;与R-NLC相比,PEG-R-NLC在脑组织(黑质、纹状体)中的分布明显升高,在外周组织中的分布均减少。结论:PEG-R-NLC能增加鱼藤酮在纹状体和黑质中的分布,进一步增强了R-NLC的脑靶向效应。

关键词：鱼藤酮纳米脂质载体聚乙二醇修饰曲线下面积脑靶向

《世界最新医学信息文摘》2003年第2卷论文索引

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世界核心医学期刊文摘（眼科学分册） 2003年第6期 961-962页

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聚乙二醇化海葵神经毒素的稳定性考察

广东药学院学报 2011年第2期27卷 121-123页

作者：舒雅俊黄慧潘育方黎小莉刘莉杨帆广东药学院药科学院广东广州510006

目的考察聚乙二醇(PEG)修饰海葵神经毒素(rhk2 a)所得产物mPEG-rhk2 a的稳定性。方法制备和纯化PEG化的修饰产物mPEG-rhk2 a,并采用RP-HPLC法分别考察rhk2 a和mPEG-rhk2 a在4、25、37℃条件下的稳定性。结果在4℃下,mPEG-rhk2 a和rhk2 ... 详细信息

目的考察聚乙二醇(PEG)修饰海葵神经毒素(rhk2 a)所得产物mPEG-rhk2 a的稳定性。方法制备和纯化PEG化的修饰产物mPEG-rhk2 a,并采用RP-HPLC法分别考察rhk2 a和mPEG-rhk2 a在4、25、37℃条件下的稳定性。结果在4℃下,mPEG-rhk2 a和rhk2 a在放置24 d后,含量分别为原来的72.96%和62.22%;在25℃下,mPEG-rhk2 a和rhk2 a在放置7 d后,含量分别为原来的56.16%和27.48%;在37℃下,mPEG-rhk2 a和rhk2 a在放置24 h后,含量分别为原来的72.12%和52.80%。结论 PEG修饰能增强rhk2 a的稳定性。

关键词：海葵神经毒素聚乙二醇修饰稳定性考察

聚乙二醇化重组人生长激素对离体豚鼠乳头肌细胞动作电位的影响

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生物医学工程与临床 2011年第4期15卷 322-324页

作者：何梦藻梁黎邹朝春赵烨钧滕懿群嘉兴市第二医院儿科浙江嘉兴314000 浙江大学医学院附属儿童医院内分泌科浙江杭州310003 嘉兴市第二医院麻醉科浙江嘉兴314000

目的探讨聚乙二醇化重组人生长激素(PEG-rhGH)对离体豚鼠乳头肌细胞动作电位的影响,并以重组人生长激素(rhGH)为阳性对照物比较二者的体外生物活性。方法健康雄性DHP豚鼠12只,随机分为2组,PEG-rhGH干预组和rhGH干预组,每组6只。采用累... 详细信息

目的探讨聚乙二醇化重组人生长激素(PEG-rhGH)对离体豚鼠乳头肌细胞动作电位的影响,并以重组人生长激素(rhGH)为阳性对照物比较二者的体外生物活性。方法健康雄性DHP豚鼠12只,随机分为2组,PEG-rhGH干预组和rhGH干预组,每组6只。采用累计给药法和给药前后自身对照方法,分别观察不同质量浓度(1、5、10、50、100、500、1 000μg/L)的PEG-rhGH和rhGH对豚鼠乳头肌细胞动作电位的效应,并比较两者效应的大小。以常规玻璃微电极技术记录和测量动作电位各参数,包括静息电位(RP)、动作电位振幅(APA)、动作电位复极50%时程(APD50)和动作电位复极90%时程(APD90)。结果 PEG-rhGH和rhGH对RP、APA均无明显影响(P>0.05),但浓度依赖性延长APD50和APD90,两者差异有显著统计学意义(P0.05)。结论 PEG-rhGH和rhGH均可延长离体豚鼠乳头肌细胞动作电位时程,以平台期为主,两者效应相近,PEG-rhGH具有与rhGH相似的体外生物活性。

关键词：重组人生长激素聚乙二醇修饰动作电位乳头肌

聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子及其药品通用名称命名

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生物技术通讯 2014年第4期25卷 601-604页

作者：任跃明国家药典委员会北京100061

有越来越多的聚乙二醇修饰人粒细胞刺激因子研发上市。为适应这类制品的发展,中国药品通用名命名原则也需要不断更新修订。简要介绍了聚乙二醇修饰蛋白技术以及WHO国际非专利药品名(INN)命名委员会对这类制品的命名情况,讨论了我国对这... 详细信息

有越来越多的聚乙二醇修饰人粒细胞刺激因子研发上市。为适应这类制品的发展,中国药品通用名命名原则也需要不断更新修订。简要介绍了聚乙二醇修饰蛋白技术以及WHO国际非专利药品名(INN)命名委员会对这类制品的命名情况,讨论了我国对这类制品的药品通用命名原则和方法,建议对聚乙二醇化不同的修饰形式在名称上适当加以区分,并注意加强与INN命名委员会的交流合作。

关键词：国际非专利名称中国药品通用名称词干聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子