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树鼩成纤维样滑膜细胞分离鉴定及TLR8通路相关分子检测方法的建立

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中国组织工程研究 2022年第23期26卷 3721-3727页

作者：周凡琦李宝莹王凯涛谭荃荃运晨霞冷静广西中医药大学基础医学院广西壮族自治区南宁530200 广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室广西壮族自治区南宁530200 柳州人民医院检验科广西壮族自治区柳州545000

背景:成纤维样滑膜细胞在类风湿关节炎病变过程中发挥着重要的作用,当炎症性关节炎发生时滑膜衬里层成纤维样滑膜细胞会大量增殖,释放炎症因子能引起关节炎症和软骨的损伤。目的:建立树鼩膝关节成纤维样滑膜细胞体外分离、培养纯化及鉴... 详细信息

背景:成纤维样滑膜细胞在类风湿关节炎病变过程中发挥着重要的作用,当炎症性关节炎发生时滑膜衬里层成纤维样滑膜细胞会大量增殖,释放炎症因子能引起关节炎症和软骨的损伤。目的:建立树鼩膝关节成纤维样滑膜细胞体外分离、培养纯化及鉴定的方法,并探讨其生物学特性;建立树鼩成纤维样滑膜细胞TLR8通路相关分子的检测方法,初探TLR8通路在细胞中的活化情况。方法:利用组织块贴壁法和连续传代法分离、纯化树鼩成纤维样滑膜细胞,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,苏木精-伊红染色观察细胞形态,免疫细胞化学染色法检测成纤维样滑膜细胞的标志性蛋白(波形蛋白)的表达。经人TLR8配体R848刺激前后,采用Western blot方法检测树鼩成纤维样滑膜细胞与人成纤维样滑膜细胞中TLR8及其信号通路蛋白的表达,采用RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳检测树鼩成纤维样滑膜细胞中TLR8通路及其下游基因mRNA的表达。结果与结论:①倒置显微镜下可见,经过3代的传代培养后,树鼩成纤维样滑膜细胞多为梭形,大小相近,纯度高,在体外生长增殖状况良好;苏木精-伊红染色显示细胞形态多呈梭形,大小相近;免疫细胞化学染色显示,成纤维样滑膜细胞胞浆波形蛋白表达阳性;CCK-8实验结果显示,树鼩成纤维样滑膜细胞生长曲线为“S”型;②Western blot检测显示,经R848刺激48 h后,树鼩成纤维样滑膜细胞中的核因子κB蛋白表达升高(P0.05);人成纤维样滑膜细胞中的p-P38蛋白表达降低(P0.05);③RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳检测显示,经R848刺激48 h后,树鼩成纤维样滑膜细胞中肿瘤坏死因子ɑ、白细胞介素6、干扰素β、TLR9-2、TLR9-1、TLR8-2、TLR8-1、TLR7-2、TLR7-1 mRNA表达无明显变化(P>0.05);④结果表明,采用组织贴壁法可分离树鼩成纤维样滑膜细胞,利用人来源抗体可建立树鼩成纤维样滑膜细胞TLR8通路相关分子检测方法。

关键词：树鼩类风湿关节炎组织贴壁法成纤维样滑膜细胞分离培养细胞鉴定 TLR8信号通路

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不同日龄鸡的原代肝细胞分离与鉴定

中国兽医科学 2022年第10期52卷 1328-1333页

作者：周静静郭晓艳杜瑞雪曹亚蒙胡薛英程国富张万坡刘晓丽谷长勤华中农业大学动物医学院湖北武汉430070

选取不同日龄肉鸡,通过剪碎法和半原位灌流法分别分离1、15、30日龄肉鸡和成年肉鸡原代肝细胞并进行培养。采用油红O染色检测脂滴存在情况,PAS染色检测糖原分泌情况,免疫组织化学法和间接免疫荧光染色法检测肝细胞特异标记物CK18。结果... 详细信息

选取不同日龄肉鸡,通过剪碎法和半原位灌流法分别分离1、15、30日龄肉鸡和成年肉鸡原代肝细胞并进行培养。采用油红O染色检测脂滴存在情况,PAS染色检测糖原分泌情况,免疫组织化学法和间接免疫荧光染色法检测肝细胞特异标记物CK18。结果显示,1日龄的鸡原代肝细胞内脂滴过多,15日龄的鸡原代肝细胞状态欠佳,30日龄和成年的鸡原代肝细胞生长状态和形态良好;原代肝细胞内存在大量的脂滴和糖原,免疫组织化学法和间接免疫荧光染色显示分离的细胞为CK18阳性细胞,即为肝细胞。结果表明,30日龄和成年肉鸡采用半原位灌流法分离得到的细胞纯度高、数量多且状态良好,且分离的肝细胞具备分泌糖原和储存脂质的功能,适合进行体外试验研究。

关键词：鸡原代肝细胞细胞分离细胞鉴定

小鼠血管壁CD34^(+)干细胞的分离、培养及鉴定

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生理学报 2023年第2期75卷 205-215页

作者：杨礼菊马颖李源党青亚程俊杨艳李鹏云西南医科大学心血管医学研究所医学电生理学教育部重点实验室医学电生理四川省重点实验室四川省心血管疾病防治协同创新中心泸州646000 西南医科大学附属医院心内科泸州646000

血管壁干细胞(vascular wall-resident stem cells,VW-SCs)在维持血管正常功能以及损伤血管的修复过程中发挥着关键性的作用,对其功能特性的研究将有助于干细胞的调控及应用。本文旨在建立稳定的VW-SCs分离、培养及分选鉴定技术,为进一... 详细信息

血管壁干细胞(vascular wall-resident stem cells,VW-SCs)在维持血管正常功能以及损伤血管的修复过程中发挥着关键性的作用,对其功能特性的研究将有助于干细胞的调控及应用。本文旨在建立稳定的VW-SCs分离、培养及分选鉴定技术,为进一步深入研究VW-SCs在生理和疾病状态下的增殖、迁移和分化等机制提供丰富、可靠的细胞来源。首先利用组织块贴壁法获取小鼠主动脉外膜以及肠系膜动脉血管壁细胞,传代培养到细胞数量至少达到1×10^(7)后经磁珠分选和流式细胞术鉴定CD34^(+)的VW-SCs;其次采用细胞免疫荧光染色检测干细胞标志物(CD34、Flk-1、c-kit、Sca-1)以及平滑肌标志物(SM22、SM MHC)、内皮标志物(CD31)和细胞核内分裂增殖相关蛋白(Ki-67);血管壁CD34^(+)干细胞的定向分化采用EBM-2内皮分化诱导培养基和FM-2成纤维细胞培养基分别培养7天和3天;利用细胞免疫荧光染色和q-PCR检测内皮细胞标志物(CD31,VWF)和成纤维细胞标志物(Vimentin,PDGFRα)的表达。此外,采用TILLvisION胞内钙信号检测系统结合Ca^(2+)荧光探针Fura-2/AM观察CD34^(+)干细胞胞内钙库Ca^(2+)释放和胞外Ca^(2+)内流特性。结果显示,血管组织块贴壁法和磁珠分选可获取较高纯度(>90%)的小鼠主动脉外膜以及肠系膜动脉血管壁CD34^(+)干细胞。体外培养的血管壁CD34^(+)干细胞可诱导分化为内皮细胞和成纤维细胞。咖啡因和ATP可显著激活CD34^(+)干细胞胞内钙库Ca^(2+)释放,毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)耗竭内质网钙库Ca^(2+)后触发钙库操纵的外钙内流(store-operated Ca^(2+)entry,SOCE)。该方法建立了稳定、高效的血管壁CD34^(+)干细胞分离、培养和鉴定技术,为体外深入研究VW-SCs的调控机制以及靶向药物的筛选提供了保障。

关键词：血管壁干细胞细胞分离细胞鉴定磁珠分选

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小鼠羊水间充质干细胞的分离、培养及鉴定

器官移植 2022年第1期13卷 67-73页

作者：吴航飞王康淳潘崎程颖中国医科大学附属第一医院器官移植科暨肝胆外科沈阳110001

目的探讨小鼠羊水间充质干细胞(AF-MSC)的分离、培养及鉴定。方法在无菌条件下获取孕鼠子宫,收集羊水后进行过滤和离心,对沉淀细胞团进行培养并传代。观察AF-MSC的形态,分析AF-MSC的增殖特点,采用流式细胞术鉴定AF-MSC的表面标志物,检测... 详细信息

目的探讨小鼠羊水间充质干细胞(AF-MSC)的分离、培养及鉴定。方法在无菌条件下获取孕鼠子宫,收集羊水后进行过滤和离心,对沉淀细胞团进行培养并传代。观察AF-MSC的形态,分析AF-MSC的增殖特点,采用流式细胞术鉴定AF-MSC的表面标志物,检测AF-MSC的三系分化能力及冷冻复苏后的细胞活力。结果小鼠AF-MSC呈典型的梭形,融合度>80%时会出现典型的漩涡状结构。小鼠AF-MSC传代培养无明显潜伏期,培养2~3 d进入对数增长期,增长速度最快,之后增殖速度减慢,进入平台期。AF-MSC表达干细胞抗原(Sca)-1、CD29、CD44,不表达CD34、CD45。小鼠AF-MSC成骨分化后,矿化结晶被茜素红染成深红色的点状;成软骨分化后,分泌的酸性粘多糖被阿利新蓝染成淡蓝色;成脂分化后,胞质脂滴被油红O染成红色。细胞冷冻复苏后存活率>95%,生长状态良好,6 d时增殖能力高于冻存前(P0.05)。结论本实验成功分离了小鼠AF-MSC,过程简便、成本低,且分离的细胞可随传代次数的增加而纯化,冻存不影响其增殖能力。

关键词：间充质干细胞羊水细胞提取细胞鉴定细胞增殖细胞冻存小鼠成骨分化成软骨分化成脂分化干细胞抗原

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乳兔心脏成纤维细胞的原代培养及鉴定

中国病理生理杂志 2023年第3期39卷 571-576页

作者：顾建军朱业张维顾翔扬州大学临床医学院附属苏北人民医院心内科江苏扬州225001

目的:探讨并建立乳兔心脏成纤维细胞原代培养方法。方法:选取新出生1 d的新西兰白兔,采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化心脏组织,差速贴壁法分离和纯化心脏成纤维细胞;使用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况,绘制细胞生长曲线;采用CCK-8法... 详细信息

目的:探讨并建立乳兔心脏成纤维细胞原代培养方法。方法:选取新出生1 d的新西兰白兔,采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化心脏组织,差速贴壁法分离和纯化心脏成纤维细胞;使用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况,绘制细胞生长曲线;采用CCK-8法检测细胞活力;波形蛋白免疫荧光细胞化学染色法鉴定细胞纯度;Western blot法检测异丙肾上腺素刺激心脏成纤维细胞后Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平。结果:差速贴壁90 min后在相差显微镜下可见部分成纤维细胞已贴壁生长;3 d后成纤维细胞数量较前增多,形态多样,多为不规则的多边形及扁平形;5 d时成纤维细胞数量显著增多(P细胞形态趋于多样性,细胞间完全融合;细胞生长曲线类似“S”形。波形蛋白阳性率可达95%。CCK-8实验结果显示在4~5 d细胞活力最强(P细胞异丙肾上腺素刺激48 h后,Col I及α-SMA水平显著增加(P细胞原代培养方法。

关键词：乳兔原代培养心脏成纤维细胞细胞鉴定

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鸵鸟胚原代组织细胞的培养及鉴定

中国家禽 2022年第9期44卷 39-46页

作者：赵梓靓原昆鹏王保俊栾庆东曲雪婷高永娟王潘龙赵悦卢艳敬尹燕博王建琳青岛农业大学动物医学院山东青岛266109 青岛博隆基因工程有限公司山东青岛266021 河北圣农生态科技开发有限公司河北石家庄050041

为研究鸵鸟胚成纤维、肝、肾、脑组织原代细胞的体外分离培养方法,试验选择28胚龄的鸵鸟胚组织,通过胰蛋白酶消化法与组织块贴壁培养法分离培养原代细胞。通过细胞HE染色形态观察、细胞活性与生长曲线测定、RT-qPCR测定细胞基因标志物... 详细信息

为研究鸵鸟胚成纤维、肝、肾、脑组织原代细胞的体外分离培养方法,试验选择28胚龄的鸵鸟胚组织,通过胰蛋白酶消化法与组织块贴壁培养法分离培养原代细胞。通过细胞HE染色形态观察、细胞活性与生长曲线测定、RT-qPCR测定细胞基因标志物对细胞类型进行鉴定。结果显示:组织块贴壁法培养的细胞12 h后开始生长,胰酶消化法分离培养的细胞,4 h后开始贴壁生长,且采用胰酶消化法获得的细胞传代后状态良好,生长变快;HE染色显示成纤维细胞、肝细胞与肾细胞为多角形或长梭形,脑细胞多呈星状与三角形;RT-qPCR结果显示,与原代细胞相比次代细胞的标志物基因ALB、CD105、CD90、CD73、WT-1、Emx-2、Wnt-4、CD133 mRNA表达水平均明显升高。研究表明,利用胰酶消化法与组织块贴壁培养法均可分离出鸵鸟胚原代细胞,但胰酶消化法分离的细胞更适合后期深入研究细胞功能,为进一步研究奠定基础。

关键词：鸵鸟胚原代细胞细胞培养细胞鉴定相对表达量生长曲线

牛成纤维细胞体外分离培养方法比较及细胞特征鉴定

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黑龙江畜牧兽医 2022年第1期 17-21,26,134页

作者：高美红白佳桦肖霖力杨凌许晓玲刘彦北京市农林科学院畜牧兽医研究所北京100097 河北工程大学河北邯郸056000

为了获得牛成纤维细胞最佳体外分离培养方法并建立成纤维细胞特征鉴定方法,试验采集牛耳皮肤组织块,利用眼科剪修剪成大小为0.5~2 mm^(3)的组织块,分别采用组织块贴壁法、胶原酶Ⅱ+组织块黏附法、双酶消化法(胰蛋白酶+胶原酶Ⅱ)+组织块... 详细信息

为了获得牛成纤维细胞最佳体外分离培养方法并建立成纤维细胞特征鉴定方法,试验采集牛耳皮肤组织块,利用眼科剪修剪成大小为0.5~2 mm^(3)的组织块,分别采用组织块贴壁法、胶原酶Ⅱ+组织块黏附法、双酶消化法(胰蛋白酶+胶原酶Ⅱ)+组织块黏附法进行原代牛耳成纤维细胞的分离培养,观察各方法培养的细胞生长情况,利用成纤维细胞特异性标志蛋白(波形蛋白)免疫荧光方法对分离获得细胞的纯度进行鉴定,采用CCK-8试剂盒对传代细胞增殖情况进行检测,绘制增殖曲线。结果表明:组织块贴壁法在培养至第7天,开始有成纤维细胞缓慢游出,并向组织块周围迁移;培养至第17天,细胞大约汇合至培养皿的80%。胶原酶Ⅱ+组织块黏附法培养至第3天时,在镜下可观察到呈絮状团块、圆形的细胞;培养至第5天时,细胞迅速生长,并且呈梭形、胞质伸展、胞核清晰、单层融合;培养至第11天时,絮状团块和培养皿边缘的细胞出现放射样和旋涡样生长晕,汇合至培养皿的70%~80%。双酶消化法+组织块黏附法培养至第3天时,在镜下观察到细胞大多呈梭形;培养至第5天时,细胞开始逐渐增加,同时细胞迁移数量、聚集程度都明显优于胶原酶Ⅱ+组织块黏附法;培养至第9天时,细胞出现旋涡样生长晕,大约汇合至培养皿的80%,可进行传代纯化。细胞染色呈阳性,且纯度高达98%。增殖曲线呈典型的S形,且2~5 d是细胞的最佳增殖期。说明通过双酶消化法+组织块黏附法可以快速分离、获得牛耳成纤维细胞,是最佳的牛成纤维细胞分离培养方法。

关键词：牛成纤维细胞分离培养方法比较细胞鉴定细胞增殖

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兔耳郭软骨细胞的分离培养与鉴定

中国组织工程研究 2022年第23期26卷 3633-3637页

作者：钟自玲瞿申红韩星吴迪广西中医药大学研究生院广西壮族自治区南宁530200 广西壮族自治区人民医院耳鼻咽喉头颈外科广西壮族自治区南宁530016

背景:基于3D打印支架材料的耳郭畸形再造是近年来的研究热点,而软骨细胞在支架上能否正常生长是其关键问题。目的:通过探讨兔耳郭软骨细胞的原代培养方法,为软骨细胞与组织工程学结合的应用奠定坚实基础。方法:采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原... 详细信息

背景:基于3D打印支架材料的耳郭畸形再造是近年来的研究热点,而软骨细胞在支架上能否正常生长是其关键问题。目的:通过探讨兔耳郭软骨细胞的原代培养方法,为软骨细胞与组织工程学结合的应用奠定坚实基础。方法:采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶序贯消化法获取兔耳郭软骨细胞,体外培养并传代。通过不同传代细胞的形态学观察、生长曲线绘制、番红O-固绿染色、甲苯胺蓝染色、维多利亚蓝染色及糖胺多糖表达水平测定,对软骨细胞进行鉴定。结果与结论:①倒置相差显微镜观察耳郭软骨细胞正常形态为梭形及多角形,传代培养6代以后成明显长梭形,且增殖速度明显减缓甚至停滞;②生长曲线绘制显示软骨细胞第2-5代均能稳定成直线增殖趋势;③番红O-固绿染色显示兔耳郭软骨细胞的细胞核结构和细胞质结构清晰,具有良好的形态学特征;④甲苯胺蓝染色提示软骨基质在培养初期分泌较少,随着细胞融合的增多而逐渐增加;⑤维多利亚蓝染色显示软骨细胞有胶原纤维生成,提示其具有正常功能;⑥糖胺多糖表达水平测定显示软骨细胞有特异性糖胺多糖的分泌;⑦实验成功建立了兔耳郭软骨细胞原代培养的分离和鉴定体系,获得了具有生物活性、可以进一步运用于组织工程学研究的耳郭软骨细胞。

关键词：耳郭再造软骨细胞原代培养细胞鉴定序贯消化法

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黑羽番鸭成肌细胞的分离培养与鉴定

江苏农业科学 2023年第24期51卷 155-160页

作者：王丽王锋超张玲王洁董飚王军陈嘉皓王健江苏农牧科技职业学院江苏泰州225300 江苏省南京市六合区竹镇镇畜牧兽医站江苏南京211501 国家水禽基因库(江苏) 江苏泰州225300 泰州第二中学江苏泰州225300

为建立番鸭成肌细胞体外分离培养和鉴定体系,选取不同胚龄黑羽番鸭为材料,利用Ⅱ型胶原酶和胰酶消化鸭胚腿肌获得成肌细胞,再经过3次差速贴壁进一步纯化,最后采用含2%马血清的培养基对分离纯化的成肌细胞进行分化诱导,结合细胞形态的观... 详细信息

为建立番鸭成肌细胞体外分离培养和鉴定体系,选取不同胚龄黑羽番鸭为材料,利用Ⅱ型胶原酶和胰酶消化鸭胚腿肌获得成肌细胞,再经过3次差速贴壁进一步纯化,最后采用含2%马血清的培养基对分离纯化的成肌细胞进行分化诱导,结合细胞形态的观察、成肌细胞增殖期及分化期的标志基因的表达情况的检测鉴定分离的成肌细胞。结果显示,分离纯化得到的成肌细胞在贴壁后呈现纺锤形,进行分化处理后出现细胞融合。从E17鸭胚腿肌中获得的成肌细胞较E15、E16和E18中分离培养的效果更好,且经差速贴壁法纯化后大部分细胞中均检测到标志基因Desmin的表达,表明纯化后成肌细胞纯度较好。成肌细胞诱导分化处理48 h后,成肌调控因子MyoD的表达显著上调;成肌细胞增殖期特异性表达的Myf5显著性降低;分化期特异性表达的基因MyHC、MyoG以及MRF4均显著性增加。综上所述,本试验成功分离和鉴定了黑羽番鸭成肌细胞,可为研究番鸭肌肉发育和分子调控机制提供参考。

关键词：黑羽番鸭成肌细胞细胞分离培养细胞分化细胞鉴定