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台湾海峡 2010年第2期29卷 184-188页

作者：林梵宇徐丽美杨丰国家海洋局第三海洋研究所生物遗传资源国家海洋局重点实验室福建厦门361005

对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是危害对虾养殖业的主要病原,而WSSV极早期基因对病毒功能基因的转录翻译和调控起着至关重要的作用.本研究将WSSV基因组以超声法随机断裂至400～900bp DNA片段,并插入启动子缺失且... 详细信息

对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是危害对虾养殖业的主要病原,而WSSV极早期基因对病毒功能基因的转录翻译和调控起着至关重要的作用.本研究将WSSV基因组以超声法随机断裂至400～900bp DNA片段,并插入启动子缺失且多克隆位点下游具有报告基因的载体来构建文库,转染昆虫细胞Hi5.倒置荧光显微镜观察发现部分转染后的细胞有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,表明这部分细胞中的DNA片段可能具有极早期启动子活性.流式细胞仪分析显示,这部分荧光细胞占总细胞的比例为0.35%.由于转染效率为50%,可认为占比0.7%的WSSV基因组随机片段能在Hi5细胞中激发下游报告基因的转录翻译,可能具有极早期基因启动子活性.这对于进一步筛选和鉴定WSSV极早期基因及开展极早期启动子研究具有重要的意义.

关键词：海洋生物学对虾白斑综合症病毒极早期基因启动子筛选文库增强型绿色荧光蛋白

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紫杉醇产生菌cDNA文库的构建

紫杉醇产生菌cDNA文库的构建

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作者：肖珊黑龙江大学

学位级别：硕士

抗癌药物紫杉醇已在临床上广泛应用,但受原料红豆杉树木短缺的制约,存在巨大的供需差距,而内生真菌发酵生产紫杉醇是解决紫杉醇药源问题的很有前景的途径之一。本研究以紫杉醇产生菌HDFS4-26为材料,在其紫杉醇合成期,用TRIzolReagent提... 详细信息

抗癌药物紫杉醇已在临床上广泛应用,但受原料红豆杉树木短缺的制约,存在巨大的供需差距,而内生真菌发酵生产紫杉醇是解决紫杉醇药源问题的很有前景的途径之一。本研究以紫杉醇产生菌HDFS4-26为材料,在其紫杉醇合成期,用TRIzolReagent提取的总RNA,构建cDNA文库,提取初级cDNA文库混合质粒。并根据GenBank中已经提交的20种红豆杉细胞中紫杉醇生物合成途径上的关键酶基因的序列,分析并选择合适的区域,合成biotin标记的探针,应用Dynal磁珠构建固定化亲和体系;然后与初级cDNA文库混合质粒进行杂交,洗脱得到筛选后的文库质粒,电转化DH10B得到筛选文库,针对筛选文库进行了580个单克隆单向测序,并进行了 EST数据分析。本试验研究为从基因组水平研究产紫杉醇内生真菌提供了重要的信息;同时也为研究内生真菌紫杉醇生物合成中相关基因及其功能分析奠定了坚实的基础,为构建高产紫杉醇基因工程菌株奠定了基础。本试验研究结果如下:1.紫杉醇产生菌HDFS46在S-7发酵培养基中发酵培养,发酵培养至第9d其发酵液经薄层层析结果显示紫杉醇量达到高峰。2.构建的初级cDNA文库库容量为2.3×l07,重组率达95%,平均插入片段长度大于1 kb,随机挑取32个克隆正反向测序,共28个克隆得到有效测序,其中22个克隆测通(平均序列长度1260bp),将这22个克隆的插入序列输入NCBI网站进行Blast分析和通过ORF预测蛋白全长,22个克隆预测蛋白全长均大于100aa,其中5个克隆长度大于300aa,14个克隆长度介于200～300aa,据此判断所构建文库全长比例大于50%,达到覆盖遗传信息的标准。3.筛选后的文库库容量为1.75×106,重组率达94%,平均插入片段长度大于1kb。4.以筛选后的文库为基础随机选取580个克隆进行5’端测序,去除低质量序列和小于100bp的序列后,经过软件拼接,共得到533条unigene,包含39条序列重叠群和494条单拷贝EST,序列的平均长度为807bp。5.利用BLASTX和NCBI非冗余蛋白库比对,533条unigene与现有数据库中的序列存在明显的相似性且具有功能的(E

关键词：紫杉醇内生真菌 cDNA文库筛选文库 EST

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白粉菌诱导的中国野生葡萄环化cDNA文库中抗病基因筛选

白粉菌诱导的中国野生葡萄环化cDNA文库中抗病基因筛选

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作者：杜敬西北农林科技大学

学位级别：硕士

本次研究的主要目的是从环化的中国华东葡萄白河35-1经白粉菌接种诱导后的叶片所构建的cDNA文库中,筛选抗病相关基因序列。根据植物抗病基因在氨基酸水平上的保守结构域NBS的P-loop区和LRR设计特异引物,采用三维文库筛选法,对环化的葡... 详细信息

本次研究的主要目的是从环化的中国华东葡萄白河35-1经白粉菌接种诱导后的叶片所构建的cDNA文库中,筛选抗病相关基因序列。根据植物抗病基因在氨基酸水平上的保守结构域NBS的P-loop区和LRR设计特异引物,采用三维文库筛选法,对环化的葡萄白粉菌接种诱导后的叶片cDNA文库进行PCR筛选。共建组池24个,每个组池中含有单菌落768个,包含18 432个克隆。从中筛选出具有抗病基因保守序列的阳性克隆585个,其中具有NBS保守序列引物筛选出330个,LRR保守序列引物筛选出255个。对获得的阳性克隆的插入片段进行了测序,经生物信息学分析去除重复序列后,获得422条具有抗病基因保守结构域的基因序列,其中具有NBS保守序列的259条,具有LRR保守序列的163条,共有NBS和LRR保守结构域的序列25条（GW915678～GW915698, GW787740, GW787753, GW787759, GW7757）。经翻译分析,其中8条编码产物包含NBS的P-loop结构域（GW787739~787742, GW787746, GW787747, GW787749, GW787758）,5条编码产物包含LRR结构（GW787743,GW787744,GW787750,GW787751,GW787753）,1条华东葡萄特有基因（GW787754）。从中选出具有不同抗病结构域的10条基因进行病源侵染过程中的基因实时定量表达分析,发现其中5条抗病相关基因的表达可被病原菌接种诱导,可能与白粉病侵染过程有关。

关键词：中国野生葡萄 cDNA文库筛选文库抗病基因定量PCR

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