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碳水化合物结合模块-嗜热子囊菌角质酶融合蛋白在PET降解中的应用

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生物工程学报 2022年第1期38卷 217-225页

作者：张颖刘展志李光耀付雪妮张钰成王志远田亚平吴敬江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学教育部食品安全国际合作联合实验室江苏无锡214122

随着全球经济的发展,聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料的生产量大幅提高,其废弃总量也逐年递增。废弃PET处理方法主要包括填埋、焚烧及生物降解等。填埋和焚烧均会造成二次污染,而生物降解因其环境友好特性逐渐成为研究热点。相关研究表明... 详细信息

随着全球经济的发展,聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料的生产量大幅提高,其废弃总量也逐年递增。废弃PET处理方法主要包括填埋、焚烧及生物降解等。填埋和焚烧均会造成二次污染,而生物降解因其环境友好特性逐渐成为研究热点。相关研究表明,碳水化合物结合模块(carbohydrate binding module,CBM)可以有效增强PET降解酶对PET的吸附,从而增加降解速率。通过大引物PCR (megaprimer PCR of whole plasmids,MEGAWHOP)技术,将炭疽杆菌(Bacillus anthraci)来源的CBM与嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)角质酶(Tfuc)构建融合蛋白Ba CBM2-Tfuc并表征其PET降解性能。在60℃条件下,Ba CBM2-Tfuc降解PET膜的效率是Tfuc的2.8倍。本研究可为构建高效降解PET的融合蛋白提供技术支持。

关键词：聚对苯二甲酸乙二醇酯生物降解角质酶碳水化合物结合模块融合蛋白

里氏木霉纤维二糖水解酶碳水化合物结合模块的合成及折叠优化

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里氏木霉纤维二糖水解酶碳水化合物结合模块的合成及折叠优化

作者：赖子健江南大学

学位级别：硕士

纤维素酶是木质纤维素转化的重要酶系,其可以水解不同位置的糖苷键从而形成葡萄糖。碳水化合物结合模块(Carbohydrate binding module,CBM)是纤维素酶的重要组成部分,其虽然没有催化活力,但可以拉近酶与底物的距离,从而提高酶的催化效率... 详细信息

纤维素酶是木质纤维素转化的重要酶系,其可以水解不同位置的糖苷键从而形成葡萄糖。碳水化合物结合模块(Carbohydrate binding module,CBM)是纤维素酶的重要组成部分,其虽然没有催化活力,但可以拉近酶与底物的距离,从而提高酶的催化效率。CBM的理化性质与纤维素酶的催化效率息息相关。若要提高CBM的理化性质,就需要获得不同糖结构、糖基化位点对CBM结构的影响。然而,由于天然来源的CBM都是难分离的糖基化异型体混合物,难以开展CBM的构效关系解析。因此需要制备得到多种结构明确、均一的CBM糖基化异型体。基于多肽固相合成(Solid phase peptide synthesis,SPPS)的化学合成法是一种更精确、更灵活的方法,可以制备出纯度较高的、在糖结构上具有系统差异的糖基化异型体。在CBM糖基异型体合成过程中,折叠是最后一步,也是关键的一步。传统CBM折叠方法需过夜处理,存在耗时耗力的不足之处,不适于CBM的大量制备。因此,对CBM氧化折叠的优化是提高其合成效率的必要步骤。本研究合成了里氏木霉家族7纤维二糖水解酶(Trichoderma reesei Family 7cellobiohydrolase,Tr Cel7A)的家族1 CBM甘露糖基异型体。此CBM序列为TQSHYGQCGGIGYSGPTVCASGTTCQVLNPYYSQCL,具有36个氨基酸,2个二硫键,T h r 1、S e r 3和S e r 1 4三个O-糖基化位点。合成过程中所需的糖氨基酸有Fmoc-Thr(Ac4Manα)-OH、Fmoc-Thr(Ac4Manα1-2Ac3Manα)-OH、Fmoc-Ser(Ac4Manα)-OH、Fmoc-Ser(Ac4Manα1-2Ac3Manα)-OH。共合成得到十种CBM糖基异型体,从一级结构的合成至折叠完成,肽链的总产率最低为9%,最高为30%。此外,对CBM折叠过程中使用的GSH/GSSG的比例、温度、p H、硫醇/二硫化物和浓度、蛋白浓度等条件进行系统的改变和优化。利用超高效液相色谱和质谱联用仪分析同分异构体的变化和二硫键的形成,从而判断折叠的进行。结果表明,在室温下,67μM浓度的CBM要90 min才能反应完全。通过优化条件,发现CBM折叠的最佳温度为25-35oC,折叠缓冲液最佳p H为9,GSH/GSSG的最佳比例为6:1-8:1。调整温度、p H和改变还原剂/氧化剂比例可以使折叠速度加快,但是仍需40 min反应才可以完成,优化效果并不明显。使用L-半胱氨酸/L-胱氨酸这对氧化还原试剂可以进一步提高CBM折叠速度。当折叠条件为:L-半胱氨酸:L-胱氨酸=8:1,L-半胱氨酸+L-胱氨酸=9 m M,p H=9,仅需10分钟即可完成反应,比常用的折叠方法快了近9倍。此外,在334μM浓度下进行折叠虽然产率降低了12%,但是制备效率提高了5倍,大幅降低时间成本。本研究不仅为CBM的高效制备提供了参考,也为CBM的性能改造提供了一种思路。

关键词：纤维素酶碳水化合物结合模块多肽固相合成氧化折叠

一种新型褐藻胶裂解酶及其截短体对酶学性质的影响

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生物加工过程 2024年第2期22卷 156-165页

作者：李辉梅王文文储建林何冰芳吴斌钦松南京工业大学生物与制药工程学院江苏南京211800 南京工业大学药学院江苏南京211800

褐藻寡糖是褐藻胶的降解产物,因独特的理化性质而具有抗肿瘤、促进生长和调节免疫等功效,受到广泛关注。为了挖掘更高效的褐藻胶裂解酶用于制备褐藻寡糖,对采集于海边土壤中的微生物进行筛选,以获得能够降解褐藻胶的菌株,并从其基因组... 详细信息

褐藻寡糖是褐藻胶的降解产物,因独特的理化性质而具有抗肿瘤、促进生长和调节免疫等功效,受到广泛关注。为了挖掘更高效的褐藻胶裂解酶用于制备褐藻寡糖,对采集于海边土壤中的微生物进行筛选,以获得能够降解褐藻胶的菌株,并从其基因组中克隆表达出褐藻胶裂解酶,考察酶的催化特性。结果发现:从Paenibacillus lautus A2中鉴定出的一种新颖的褐藻胶内切酶AlgC2m,含有439个氨基酸,与PL7家族的AlgL仅有38%的最高序列一致性,其N端的碳水化合物结合模块(CBM32)和C端催化域(CD)通过一个连接子连接。AlgC2m和其截短体AlgC2m-CD降解褐藻酸钠的酶活分别为331.05和82.47 U/μmol,最适温度分别为45和30℃。另外,AlgC2m-CD对聚α-L-古罗糖醛酸(polyG)具有更明显的偏好性,酶解产物除二糖和三糖外,还有聚合度更高的四糖。

关键词：褐藻胶裂解酶碳水化合物结合模块非催化结构域 Paenibacillus lautus 产物分布

N端非催化结构域对微泡菌ALW1褐藻胶裂解酶AlgL7酶学性质的影响

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食品科学 2023年第16期44卷 169-176页

作者：黄小艺李鹤宾陈艳红姜泽东倪辉李清彪朱艳冰集美大学海洋食品与生物工程学院福建厦门361021 厦门医学院药学系福建厦门361023 福建省食品微生物与酶工程重点实验室福建厦门361021 厦门市食品生物工程技术研究中心福建厦门361021

为了明确非催化结构域碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module,CBM)和F5/8 C型结构域对褐藻胶裂解酶AlgL7酶学性质的影响,构建并表征了全长酶AlgL7和两个截短酶CD1(催化结构域)和CD2(包含F5/8 C型结构域和催化结构域)。结果表... 详细信息

为了明确非催化结构域碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module,CBM)和F5/8 C型结构域对褐藻胶裂解酶AlgL7酶学性质的影响,构建并表征了全长酶AlgL7和两个截短酶CD1(催化结构域)和CD2(包含F5/8 C型结构域和催化结构域)。结果表明,与全长AlgL7相比,截短酶CD2表现出更高的比活力、热稳定性和K_(m)值,以及更高的最大反应速率(V_(max)值),表明CBM结构域在保持酶与底物的亲和力方面具有重要作用,但降低了酶的催化活性、热稳定性和V_(max)值。与截短酶CD1相比,CD2表现出更高的比活力、最适反应温度、热稳定性、最大反应速率和Km值,表明F5/8 C型结构域有利于提高酶的催化活性、最适反应温度、热稳定性和最大反应速率,但降低了酶与底物的亲和力。以海藻酸钠为底物,截短酶CD2的比活力为183.9 U/mg,最适反应温度和最适反应pH值分别为40℃和7.0,K_(m)值和V_(max)值分别为39.80 mg/mL和2000 U/mg,酶解产物主要为褐藻胶寡糖二糖和三糖。本研究促进了非催化结构域与褐藻胶裂解酶性质的构效关系研究,为利用非催化结构域改善褐藻胶裂解酶的催化性质提供了一定理论基础。

关键词：褐藻胶裂解酶碳水化合物结合模块 F5/8 C型结构域酶学性质酶解产物

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CBM在多糖底物降解中的应用进展

微生物学报 2023年第6期63卷 2330-2339页

作者：倪新杨帆大连工业大学生物工程学院辽宁大连116034

碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module, CBM)是碳水化合物活性酶的重要组成部分,其功能是识别并结合到特定的多糖底物上以提高催化结构域在底物附近的浓度及催化效率,帮助其更好地降解如纤维素、木聚糖、几丁质和黄原胶等大... 详细信息

碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module, CBM)是碳水化合物活性酶的重要组成部分,其功能是识别并结合到特定的多糖底物上以提高催化结构域在底物附近的浓度及催化效率,帮助其更好地降解如纤维素、木聚糖、几丁质和黄原胶等大分子化合物。不同家族的CBM因其来源或结构不同往往会具有不同的底物结合特性。本文从CBM的家族、结构和功能等方面对CBM近年来的研究进行了综述,特别是对其作为融合单元运用到多糖底物的降解和糖苷水解酶改造方面的应用进行了总结。

关键词：碳水化合物结合模块多糖底物糖苷水解酶改造

新型甘露聚糖酶-乙酰酯酶双功能酶的功能和结构域协同研究

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微生物学报 2020年第12期60卷 2690-2704页

作者：刘亮刘佳文王若楠张瑜李宝珍袁红莉中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室农业部土壤微生物学重点实验室北京100193

【目的】分析鉴定高效木质纤维素降解菌群EMSD5来源的新型甘露聚糖酶-乙酰酯酶双功能酶44884,解析催化域间的协同关系,以及碳水化合物结合模块(CBM)对催化域特性的影响,拓展对该类双功能酶的认识,为甘露聚糖酶的升级改造和应用提供依据... 详细信息

【目的】分析鉴定高效木质纤维素降解菌群EMSD5来源的新型甘露聚糖酶-乙酰酯酶双功能酶44884,解析催化域间的协同关系,以及碳水化合物结合模块(CBM)对催化域特性的影响,拓展对该类双功能酶的认识,为甘露聚糖酶的升级改造和应用提供依据。【方法】通过大肠杆菌异源表达甘露聚糖酶-乙酰酯酶双功能酶44884,并构建截短和定点突变的突变体,利用TLC和DNS法比较野生型和突变体的酶学性质。【结果】成功对44884全长和突变蛋白进行克隆表达,并发现44884中2个催化域能够彼此促进各自产物的释放,而且以双功能酶形式存在时,这种促进效果更为明显。44884中的2个CBM65均有甘露聚糖和结晶纤维素结合活性,且CBM65的存在并不改变甘露聚糖酶和乙酰酯酶的最适反应条件和水解模式。虽然CBM65显著降低了2个催化域的热稳定性,但水解天然底物时,2个CBM65对各自临近催化域的水解具有明显的促进效果。【结论】本研究首次发现并探究了新型甘露聚糖酶和乙酰酯酶形成的双功能酶44884的功能,解析了催化域之间高效的协同效应,以及新型甘露聚糖结合模块CBM65对双功能酶水解的促进作用。

关键词：双功能酶甘露聚糖酶乙酰酯酶结构域协同碳水化合物结合模块

普鲁兰酶N端结构域CBM68对酶学性质的影响

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南开大学学报（自然科学版） 2018年第4期51卷 93-99页

作者：曾艳郑宏臣付晓平徐健勇宋诙刘方南开大学生命科学学院天津300071 中国科学院天津工业生物技术研究所工业酶国家工程实验室天津300308 中国科学院天津工业生物技术研究所天津工业生物系统与过程重点实验室天津300308

碳水化合物结合模块(Carbohydrate Binding Modules,CBMs)在普鲁兰酶结构中普遍存在,对酶的催化性质起重要作用.本文将酸性普鲁兰酶Pul B的N端结构域CBM41-X45替换成耐热普鲁兰酶Pul A的N端结构域CBM68,得到重组酶Pul-11,同时将Pul-11... 详细信息

碳水化合物结合模块(Carbohydrate Binding Modules,CBMs)在普鲁兰酶结构中普遍存在,对酶的催化性质起重要作用.本文将酸性普鲁兰酶Pul B的N端结构域CBM41-X45替换成耐热普鲁兰酶Pul A的N端结构域CBM68,得到重组酶Pul-11,同时将Pul-11的催化结构域替换成Pul A的催化结构域,得到重组酶Pul-12.结果显示,重组酶Pul-11和Pul-12的最适温度均较Pul B提高了10℃,最适pH分别提高了0.5和1;60℃下热稳定性分别提高了41.4%和44.0%;同时,重组酶Pul-11和Pul-12的底物亲和力和催化效率较Pul B也均有一定程度提高.可见,来源于耐热普鲁兰酶的新型底物结构域CBM68对普鲁兰酶的最适作用温度、最适作用pH及催化效率具有重要影响.

关键词：碳水化合物结合模块 CBM68 普鲁兰酶最适作用温度最适作用pH 催化效率

一种新型黄原胶酶CtCel8A-CBM84的构建及性质表征

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大连工业大学学报 2023年第4期42卷 247-253页

作者：倪新张丽伟陈晓艺李宪臻杨帆大连工业大学生物工程学院辽宁大连116034

对来自拟杆菌Paenibacillussp.62047的黄原胶内切酶PspXan9的碳水化合物结合模块PspCBM84进行了密码子优化、全基因合成并与高效的纤维素内切酶CtCel8A进行了融合表达。该基因大小为423bp,编码141个氨基酸残基,与纤维素内切酶CtCel8A融... 详细信息

对来自拟杆菌Paenibacillussp.62047的黄原胶内切酶PspXan9的碳水化合物结合模块PspCBM84进行了密码子优化、全基因合成并与高效的纤维素内切酶CtCel8A进行了融合表达。该基因大小为423bp,编码141个氨基酸残基,与纤维素内切酶CtCel8A融合表达后,编码蛋白理论分子质量为66.7ku,该酶能在大肠杆菌中可溶性表达。酶学性质分析结果表明,碳水化合物结合模块PspCBM84显著提高了纤维素内切酶CtCel8A对黄原胶的切割效率,融合酶的活力提高了1.6倍。融合酶的最适作用温度为60℃,最适pH为5.5,与原纤维素内切酶相比,融合酶的温度稳定性有所提高。融合酶CtCel8A-CBM84能有效切割黄原胶,将其水解为低分子质量产物。

关键词：纤维素内切酶碳水化合物结合模块黄原胶酶学性质

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提高内切葡聚糖酶活力及其在毕赤酵母中的表达研究

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2015年第1期36卷 72-77页

作者：唐自钟刘姗晋海军孙蓉陈惠韩学易四川农业大学生命科学与理学院四川雅安625014

以中性内切葡聚糖酶基因EG和真菌Corticium rolfsii的碳水化合物结合模块（FCBM）为模块，构建融合基因重构体EG-FCBM和CD-FCBM，并利用高效表达载体在毕赤酵母中对其进行高效表达。酶活及性质分析显示，EG-FCBM和CD-FCBM在诱导表达84～... 详细信息

以中性内切葡聚糖酶基因EG和真菌Corticium rolfsii的碳水化合物结合模块（FCBM）为模块，构建融合基因重构体EG-FCBM和CD-FCBM，并利用高效表达载体在毕赤酵母中对其进行高效表达。酶活及性质分析显示，EG-FCBM和CD-FCBM在诱导表达84～96h后，其对微晶纤维素的活力分别为951和676U·mL^-1，较原始基因EG（526U·mL^-1）提高81％、28％，而酶学性质两者间无较大差异。这一结果表明，FCBM在催化水解纤维素的过程中有着极为重要的作用，通过增加FCBM来提高纤维素酶活性方法可行。

关键词：内切葡聚糖酶碳水化合物结合模块融合基因酶学性质