检索结果-南通市图书馆

作者：鲍林文杭州师范大学

学位级别：硕士

黄瓜(Cucumis sativus L.)是一种重要的园艺和经济作物,更是植物分子生物学研究的好材料,它不需要特别的光周期诱导就能自主开花,营养生长期也很短。黄瓜的全基因组序列测定已由我国科学家于2009年完成(Huang et al.,2009),但目前尚未... 详细信息

黄瓜(Cucumis sativus L.)是一种重要的园艺和经济作物,更是植物分子生物学研究的好材料,它不需要特别的光周期诱导就能自主开花,营养生长期也很短。黄瓜的全基因组序列测定已由我国科学家于2009年完成(Huang et al.,2009),但目前尚未有关于黄瓜中生长素受体的克隆、表达模式分析及其调控机制和生物学功能的研究报道,基于此本论文开展了相关的实验,所取得主要研究成果如下：1、克隆了黄瓜中生长素受体的同源基因CsTIR和CsAFB,构建了过量表达载体35S:CsTIR和35S:CsAFB;同时构建了相应的RNA干涉载体CsTIR-RNAi和CsAFB-RNAi。2、通过烟草叶片瞬时转化实验,证明构建的RNA干涉载体可以抑制目的基因的表达,起到干涉的效果。3、建立了高效的黄瓜离体再生体系：以6天苗龄的黄瓜子叶节作为外植体,MS+0.5mg/L6-BA+2.0mg/L AgNO3再生培养25天后可以得到大量不定芽。4、确定了黄瓜转基因抗性芽潮霉素筛选的浓度为10mg/L。5、通过半定量RT-PCR鉴定了黄瓜不同组织中内源CsTIR和CsAFB基因的表达量。10天幼苗中,CsAFB和CsAFB基因的表达量都在根和叶中较高,茎中相对较少;幼苗的茎中几乎检测不到CsTJR的表达;70天成年黄瓜各组织都有CsTIR和CsAFB的表达,其中CsAFB基因在不同组织中的表达量比较一致,而CsTIR.基因在营养器官茎、叶和卷须中的表达量略高于在花芽和花中的表达量。6、将35S:CsTIR(?)和35S:CsAFB遗传转化模式植物拟南芥,已得到35S:CsTIR T2代纯合体,和35S:CsAFBT1代转基因抗性苗。

关键词：黄瓜生长素受体基因克隆 RNA干涉瞬时转化

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草甸羊茅和无芒雀麦钙、铁、锌营养评价

草甸羊茅和无芒雀麦钙、铁、锌营养评价

作者：郭燕内蒙古大学

学位级别：硕士

钙、铁和锌作为无机矿质营养,在动植物生长发育过程中发挥重要作用。植物作为生产者是营养元素进入食物链重要的环节。因此,牧草的品质对于食草动物的饲养来说十分重要。草甸羊茅(Festuca pratensis)是一种在草原中分布广泛的优质牧草... 详细信息

钙、铁和锌作为无机矿质营养,在动植物生长发育过程中发挥重要作用。植物作为生产者是营养元素进入食物链重要的环节。因此,牧草的品质对于食草动物的饲养来说十分重要。草甸羊茅(Festuca pratensis)是一种在草原中分布广泛的优质牧草。无芒雀麦(Bromus inermis)是一种具有较好的耐寒性、根系发达、营养价值高、品质优良的牧草。本课题以来自不同国家、地区的105种草甸羊茅和55种无芒雀麦为材料,通过电感耦合等离子体发射光谱仪(Inductively Coupled Plasma,ICP)进行总钙、铁和锌含量测定,并分别建立了两种牧草的瞬时表达方法,主要结果如下:(1)通过土培实验、水培实验、培养皿实验进行钙、铁和锌含量的逐次筛选,最终筛选出草甸羊茅102号(ZXY2014p-13032)为高钙品种、88号(ZXY2014p-12105)为低钙品种,高钙品种钙含量(μg/mg)约为低钙品种的1.5-3倍。筛选出铁含量相对较高的品种15号(ZXY2004P-278),约为其他品种的1.5倍。草甸羊茅根和叶锌含量未发现明显重复性。(2)对无芒雀麦采用相同方法筛选,最终发现钙含量较高品种为46(ZXY2013p-11390)号,大约为其他品种钙含量的1.5倍。55份无芒雀麦锌和铁含量并无明显重复性。(3)为了进一步分析草甸羊茅对离子的吸收能力,本研究进行了钡离子吸收速率的实验,结果表明,草甸羊茅高钙品种102号对于钡离子的吸收能力大于88号品种。(4)为了探究草甸羊茅不同叶片对钙的积累,测定了102号和88号的老叶及新叶的钙、铁和锌含量,结果表明草甸羊茅的老叶中具有更高的钙含量和锌含量的积累,而且102号钙含量始终大于88号。草甸羊茅的老叶中并没有表现出对微量元素铁含量更高的积累。(5)最后,本研究建立了农杆菌介导的草甸羊茅和无芒雀麦的瞬时表达方法,成功的在草甸羊茅的内质网、高尔基体、过氧化物酶体中及无芒雀麦过氧化物酶体中表达了红色荧光蛋白。目前,对于牧草种质钙、铁和锌含量的相关研究还比较少,本论文首次对来自不同国家地区的105种草甸羊茅和55种无芒雀麦材料的钙、铁和锌含量系统测定,该研究结果对优良的草甸羊茅和无芒雀牧草品种的评价具有重要的价值。瞬时转化方法的建立也为后续相关基因的功能研究奠定了基础。

关键词：草甸羊茅钙含量瞬时转化无芒雀麦筛选

加工番茄eIF4E和eIF(iso)4E基因人工突变体的培育及其对PVY病毒抗性的研究

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加工番茄eIF4E和eIF(iso)4E基因人工突变体的培育及其对PVY病毒抗...

作者：付紫梅石河子大学

学位级别：硕士

真核翻译起始因子eIF4E(eukaryotic translation inititon factor 4E)是一个大的基因家族,由多个基因编码,在生物体中行使重要的生物学功能。在番茄中已鉴定的编码eIF4E的基因有三个,分别为eIF4E1、eIF4E2、和eIF(iso)4E。前期研究发现... 详细信息

真核翻译起始因子eIF4E(eukaryotic translation inititon factor 4E)是一个大的基因家族,由多个基因编码,在生物体中行使重要的生物学功能。在番茄中已鉴定的编码eIF4E的基因有三个,分别为eIF4E1、eIF4E2、和eIF(iso)4E。前期研究发现马铃薯Y病毒的VPg蛋白((viral genome-linked protein,VPg)能够选择性地利用eIF4E来协助病毒mRNA的翻译和在寄主细胞间的扩散。目的:利用CRISPR/Cas9技术分别构建能够特异性地靶向编辑加工番茄eIF4E1、eIF4E2、和eIF(iso)4E基因的载体。以构建的eIF4E1基因的靶向编辑载体为例,通过瞬时转化的方法快速获知载体的有效性后分别遗传转化加工番茄,不仅为CRISPR/Cas9系统在培育PVY抗性植株中的应用提供技术支持,同时也为新疆加工番茄的品种改良奠定基础。方法:以实验室前期构建的CRISPR/Cas9系统原件为基础,利用Vector NTI生物学软件分别选取了eIF4E1、eIF4E2、和eIF(iso)4E基因的靶序列,以此为基础,构建能够靶向加工番茄eIF4E1、eIF4E2、和eIF(iso)4E基因的CRISPR/Cas9系统表达载体;以构建的eIF4E1基因的CRISPR/Cas9靶向编辑载体为例,通过农杆菌介导的瞬时转化的方法来快速获知本研究应用CRISPR/Cas9系统构建的载体的有效性;将利用两套CRIS PR/Cas9系统构建的六个载体分别遗传转化加工番茄;所获得的转基因植株采用限制性内切酶分析法进行突变情况的鉴定。结果与结论:(1)本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统构建的eIF4E靶向编辑载体由两部分构成。其中含靶序列sgRNA的表达框由RNA聚合酶Ⅲ型的番茄U6启动子进行启动,由于番茄U6启动子的转录起始位点通常是G,所以本研究利用Vector NTI软件设计的靶序列的5’端第1个碱基为G。Cas9蛋白由花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子启动并且在N端均添加了核定位信号序列(Nuclean localization signal,NLS)。本研究突变体检测方法采用限制性内切酶分析法,因此设计的靶序列包含特异性的限制性内切酶识别位点。(2)本研究采用了真空渗透的瞬时转化方法来对已构建的CRISPR/Cas9系统载体有效性进行评估,核苷酸序列比对结果显示,已测序的9个阳性克隆都存在突变,并且所有的突变情况均为单碱基的替换,这导致加工番茄eIF(iso)4 E基因靶序列处的多肽链中出现单个氨基酸的替换。(3)瞬时转化后,突变情况检测的酶切电泳结果显示,未切开的条带相对较亮,这表明瞬时转化过程中,被转化的细胞所占的比例较大,同时表明本研究所采用的真空渗透的瞬时转化方法的转化效率较高,可用于后续CRIS PR/Cas9系统应用过程中的靶序列评估实验。

关键词： CRISPR/Cas9 elF4E PVY 瞬时转化遗传转化

丹参2,3-环氧鲨烯环化酶的克隆及功能研究

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丹参2,3-环氧鲨烯环化酶的克隆及功能研究

作者：杨悦东北林业大学

学位级别：硕士

丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)属于唇形科鼠尾草属植物,因其干燥的根和根茎中的活性成分而常被作为一种药用植物来研究,在医治心脑血管类疾病、抗氧化及抗肿瘤等问题上有显著疗效。现今研究人员大多关注于对丹参次生代谢中二萜类化合... 详细信息

丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)属于唇形科鼠尾草属植物,因其干燥的根和根茎中的活性成分而常被作为一种药用植物来研究,在医治心脑血管类疾病、抗氧化及抗肿瘤等问题上有显著疗效。现今研究人员大多关注于对丹参次生代谢中二萜类化合物丹参酮的研究,而对丹参中三萜类化合物的相关代谢研究甚少,但是丹参中也含有许多具有药用活性的三萜类化合物,所以对三萜类化合物代谢途径的解析还有待研究。本文在前期建立的丹参转录组数据库的基础上,对转录组进行深度挖掘,获得了一个2,3-环氧角鲨烯环化酶的unigene序列,进一步通过RACE技术得到2,3-环氧角鳘烯环化酶的cDNA全长序列,并对这条2,3-环氧角鲨烯环化酶进行克隆及功能鉴定。主要结果如下:1.从丹参中克隆得到了一个2,3-环氧角鲨烯环化酶基因SmOSC,全长为2298bp,编码765个氨基酸残基,经序列比对和进化树分析,推测这条基因可能在三萜类化合物的生物合成中编码2,3-环氧角鲨烯环化酶。进一步进行生物信息学分析,通过PSORT在线服务器对SmOSC进行了亚细胞定位分析,应用ExPASy Proteomics Server中Protparam在线软件对蛋白进行了理化性质的预测分析,最后利用predictprotein及Swiss-model生物学软件分别预测该基因可能编码的蛋白质二级和三维结构并建立结构模型,结果发现丹参中的SmOSC与人参中的三萜环化酶PgDDS具有很高的同源性。2.通过Gateway的方法,将SmOSC基因先通过BP反应构建到入门载体pDonr207中,再通过LR反应,重组到pAg1423酵母表达载体上,再转化Y21900酵母突变菌株。通过酵母发酵,进行体内的酶活反应后,提取酵母中的产物进行检测分析。利用高效液相色谱及Q-Exactive(QE)质谱仪对化合物进行分析,结果显示产物为达玛烯二醇(DM Ⅱ)。3.以微生物作为底盘细胞进行的研究比较普遍,而本文在酵母体系研究的基础上,又考虑植物底盘,模式植物本氏烟草(Nicotianabenthamiana)因为其生长周期短而被作为理想的研究对象。选取在温室中生长6周的本氏烟草对SmOSC进行瞬时表达。利用Gateway的方法构建表达载体pEAQ-SmOSC,通过农杆菌GV3101介导转化本氏烟草。瞬转后在温室正常生长4天后,用甲醇进行提取,并通过QE检测其产物,结果能够检测到DM-Ⅱ,而对照中则检测不到DM-Ⅱ,说明SmOSC在烟草体系中能够催化生成DM-Ⅱ。4.运用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)技术,研究SmOSC在丹参的根、茎、叶和花中基因表达的差异性。首先对不同组织的RNA进行提取,设定Actin为内参基因。结果显示SmOSC在丹参的叶和花中表达较高,各组织的表达量从大到小依次是花>叶>茎>根,即在丹参地上部分SmOSC的转录表达水平较高,其在花、叶中表达量约是茎、根中表达量的3.6倍。我们推测这可能与植物的逆境胁迫有关。为了证实这一推测,我们随后进行了激素诱导的表达实验,即向丹参植株施加外源激素茉莉酸甲酯(MJ)、乙烯(ET)、赤霉素(GA)、脱落酸(ABA)和水杨酸(SA),诱导处理2h后,提取叶中RNA,对SmOSC进行实时荧光定量PCR分析,结果发现与对照CK相比,SmOSC在脱落酸、水杨酸、赤霉素、茉莉酸甲酯的调节下,其表达明显受到抑制,而在乙烯诱导下的表达量没有明显的变化,说明脱落酸、水杨酸、赤霉素及茉莉酸甲酯等介导的胁迫途径能够影响丹参中SmOSC的表达。

关键词：丹参 2,3-环氧鲨烯环化酶酵母表达瞬时转化达玛烯(DM Ⅱ)

蝴蝶兰茉莉酸合成途径基因的表达特征及CfJMT基因的遗传转化研究

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蝴蝶兰茉莉酸合成途径基因的表达特征及CfJMT基因的遗传转化研究

作者：田春玲南京农业大学

学位级别：硕士

蝴蝶兰(Phalaenopsis spp.)为兰科(Orchidaceae)蝴蝶兰属多年生附生草本植物,其花型奇特,花色鲜艳,具有较高的观赏价值,深受大众喜爱,被誉为“兰花皇后”,已成为世界范围内广泛栽培的观赏植物之一。香味是观赏植物的重要性状之一,而多... 详细信息

蝴蝶兰(Phalaenopsis spp.)为兰科(Orchidaceae)蝴蝶兰属多年生附生草本植物,其花型奇特,花色鲜艳,具有较高的观赏价值,深受大众喜爱,被誉为“兰花皇后”,已成为世界范围内广泛栽培的观赏植物之一。香味是观赏植物的重要性状之一,而多数蝴蝶兰均无香味,但其花期较长,目前关于蝴蝶兰花香的机理研究较少,其机制尚未明确。兰科兰属温带地生兰花器官具有浓烈的香气,但花期较短,研究表明茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate MeJA)是其主要的挥发性香味成分之一,而花期相对较短与乙烯合成旺盛有关。因此,推测MeJA的大量产生使花器官具有香味,但诱导了乙烯的产生,从而导致花器官易衰老脱落。而蝴蝶兰无香味、花期较长的性状,可能与茉莉酸代谢途径产生MeJA少相关,为了探明蝴蝶兰不具香味且花期长的机理,本研究将通过对不同种蝴蝶兰的转录组数据进行分析,以明确其茉莉酸代谢途径基因的表达特征。并进一步分析瞬时过表达蕙兰CfJMT基因对蝴蝶兰茉莉酸代谢途径和乙烯代谢途径的影响;结合CfJMT基因异源转化矮牵牛(Petunia hybrida)的表型分析,探讨利用CfJMT基因提高茉莉酸甲酯产生的可能性,为具香味蝴蝶兰新品种的培育提供基础。主要研究结果如下:1、通过对NCBI已公布的5种蝴蝶兰的转录组数据进行分析,筛选出蝴蝶兰苿莉酸代谢途径的主要基因,结果表明,该代谢途径大部分基因均能正常表达,但所分析的5种蝴蝶兰中均未检索到MeJA合成关键基因JMT基因。进一步结合乙烯代谢途径基因的表达特征分析结果,推测JMT基因的缺失可能是蝴蝶兰无MeJA产生并挥发香气的直接原因。2、为了验证蝴蝶兰花器官中MeJA是否对乙烯合成产生影响,利用150 μM的MeJA和2 μl/L的乙烯利分别处理蝴蝶兰花朵,发现二者在处理4 d后花瓣均开始表现出脱水症状,8 d后所有处理组花瓣脱水衰老程度加剧,表明MeJA可以引起蝴蝶兰花瓣的衰老。该现象可以作为外源JMT基因转化积累MeJA的间接指标。3、进一步构建了蕙兰MeJA合成关键基因CfJMT的瞬时表达载体pGreenⅡ62-SK-CfJMT,并转入农杆菌。通过农杆菌对蝴蝶兰花瓣圆片进行了瞬时转化分析,结果显示,转化处理的花瓣褪色衰老明显。荧光定量分析结果表明,茉莉酸代谢途径上游基因表达变化不明显;但衰老相关基因SAG和乙烯合成途径基因ACO及乙烯响应因子(ERF2)的表达提高。推测在蝴蝶兰中过表达JMT可能引起花瓣MeJA含量增加较少,并诱导了乙烯合成途径基因的表达,引起了花瓣衰老。但转化CfJMT是否引起了 MeJA含量提高并产生香味,需通过稳定转化进一步验证。4、对转蕙兰CfJMT基因的矮牵牛株系进行分析,转基因植株中MeJA未能检测到,但转基因株系叶片发育受到影响,其叶片变厚,叶肉细胞层数增加,叶片发育相关基因的表达水平发生变化,植株衰老提前。此外,过表达CfJMT基因矮牵牛株系的雌雄蕊发育受到严重影响,花粉畸形,花粉活力、结实率及果英长度等显著降低。研究结果表明,单独异源转化CfJMT未能明显增加MeJA,可能需要其他调控因子的共同作用。研究结果为蝴蝶兰的JA/MeJA合成途径的改良提供了参考。

关键词：蝴蝶兰茉莉酸生物合成途径基因表达 CfJMT 瞬时转化稳定转化

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蝴蝶兰再生体系建立及转蓝色形成基因研究

蝴蝶兰再生体系建立及转蓝色形成基因研究

作者：高壮壮西北农林科技大学

学位级别：硕士

蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)由于基因资源的限制,缺乏蓝色系品种,运用分子手段,向蝴蝶兰导入外源基因使其获得新的花色素合成能力能够跨越该种植物基因库内基因类型的限制和由于种族隔离无法直接获得其他种植物蓝色形成基因的限制,... 详细信息

蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)由于基因资源的限制,缺乏蓝色系品种,运用分子手段,向蝴蝶兰导入外源基因使其获得新的花色素合成能力能够跨越该种植物基因库内基因类型的限制和由于种族隔离无法直接获得其他种植物蓝色形成基因的限制,为定向改良植物花色育种提供理论依据。本研究以蝴蝶兰‘大辣椒’为材料,将不同来源蓝色形成基因的植物表达载体构成不同组合瞬时转化蝴蝶兰,初步探索蓝色形成基因对蝴蝶兰花色的遗传调控并筛选出适合稳定转化的载体组合,构建植物稳定转化表达载体;同时研究了蝴蝶兰外植体取材、消毒方式、基本培养基、6-BA和NAA的配比及浓度对不定芽诱导、增殖、生根的影响,探索建立蝴蝶兰的再生繁殖体系,设置不同潮霉素浓度,筛选类原球茎最适选择压力。取得的结果如下:1.来自葡萄风信子的Ma DFR和Ma F3?5?H载体组合在瞬时转化蝴蝶兰后,花瓣颜色变深,进一步经花青苷含量测定结果显示转化后的花瓣花青苷含量是野生型的1.32倍,从而筛选出适合稳定转化的载体组合,即Ma DFR+Ma F3?5?H。2.构建了植物双元表达载体p CAMBIA1301-Ma DFR-Ma F3?5?H,用于后续稳定转化蝴蝶兰。3.(1)花梗适合作为不定芽诱导外植体,出芽率优于花苞、花葶和花萼;(2)先用2%过氧化氢溶液处理15min,再用10%次氯酸钠溶液处理10min,消毒效果良好,花梗污染率低,为26.6%;(3)花梗诱导最适培养基为:花宝1号+花宝2号+6-BA 3 mg/L+NAA 0.05 mg/L,出芽率为78.9%;(4)不定芽增殖最适培养基为:花宝1号+6-BA 5 mg/L+NAA 0.05 mg/L,增殖系数为3.60;(5)幼苗生根最适培养基为:1/2MS+NAA 0.2 mg/L,生根率为73.7%。建立了蝴蝶兰‘大辣椒’的再生体系。

关键词：蝴蝶兰瞬时转化蓝色形成基因再生体系

杨树响应高温胁迫的转录和代谢及相关基因功能的研究

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杨树响应高温胁迫的转录和代谢及相关基因功能的研究

作者：任世雄扬州大学

学位级别：硕士

植物对高温胁迫能产生不同水平上的响应,然而木本植物在转录和代谢水平上如何响应高温还不清楚。毛白杨(Populustomentosa)是常见的城市绿化树种。本研究以毛白杨实生苗为研究材料,设置25℃常温对照和45℃高温处理,对叶片进行了细胞结... 详细信息

植物对高温胁迫能产生不同水平上的响应,然而木本植物在转录和代谢水平上如何响应高温还不清楚。毛白杨(Populustomentosa)是常见的城市绿化树种。本研究以毛白杨实生苗为研究材料,设置25℃常温对照和45℃高温处理,对叶片进行了细胞结构、生理指标、转录组及代谢组等水平上的测定,并对筛选的关键基因构建载体、遗传转化拟南芥和杨树,主要取得了以下结果:(1)通过扫描电镜观察发现杨树在高温组中(45℃)的气孔开张面积明显小于在常温对照组(25℃),高温组一些气孔几乎闭合,显示高温明显抑制叶片气孔开张。高温胁迫下,生理指标H2O2含量、CAT和SOD活性显著增加,POD活性并没有显著变化,可溶性糖含量显著下降,可溶性蛋白则无明显变化。(2)转录组测序发现7738个差异基因,其中,上调的为3888个,下调的为3850个。KEGG分析结果显示,这些差异基因的生物学功能显著富集于“光合作用”、“戊糖磷酸途径”、“糖酵解”等。GO功能分析结果显示,差异基因主要富集在“响应非生物刺激”、“响应热”、“叶绿体”、“类囊体膜”等。光合作用通路中,与光捕获复合体和光合电子传递系统相关的基因显著下调,如PSB27、PSB28、LHCA5、PETB和PETC。(3)通过代谢组鉴定到高温下叶片大量差异代谢物,其中,脂类物质4个,可溶性糖4个,无机酸和有肌酸16个。高温胁迫下,脯氨酸、棉子糖、蜜二糖的含量显著上升,丙酮酸、富马酸和肌醇的含量显著下降。(4)转录组与代谢组联合分析发现,糖酵解路径增强,而TCA循环受到抑制,尤其肌醇、磷酸盐、半乳糖、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸和脯氨酸等代谢路径都显著受到了高温胁迫的影响。(5)对转录因子进行分析,共鉴定到差异转录因子553个。其中HSFs转录因子家族基因HSFA9、HSFA3、HSFA2和HSF4在高温胁迫下显著上调表达,MYBs转录因子家族基因中,MYB27和MYB4R1显著上调。而WRKYs转录因子家族基因WRKY50和WRKY13则显著下调表达。(6)荧光定量qRT-PCR验证了与高温胁迫相关的16个基因,HSF4和HSFA9在高温处理的四个阶段均显著上调,HSP70、HSP90-6、HSFA3、HSF4和P5CS在5小时45℃时显著上调,CYP97A3、CYP97B3、DREB1、DREB2、DREB2E、DREB5、HSP21、HSP90-6、HSFA9、HSF4、HSFA3、P5CS和WRKY50在5小时45℃时表达量达到顶峰。然而HSFB4在四个阶段却均显著下调。(7)通过构建过表达载体35S:DREB2-GFP和35S:HSFA3-GFP,并瞬时转化烟草,激光共聚焦显微镜可观察到DREB2主要定位于细胞核中,HSFA3定位在细胞质和细胞膜中。拟南芥及84K杨初步转化成功。

关键词：毛白杨高温胁迫木本植物代谢组转录组转录因子瞬时转化

中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因表达及启动子分析

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中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因表达及启动子分析

作者：杜杨建西北农林科技大学

学位级别：硕士

葡萄是世界范围内重要的栽培果树之一,对人类的经济、生态及社会产生了巨大的效益。葡萄白粉菌是严重危害葡萄产量和品质的一种真菌病害,造成了广泛栽培的欧洲葡萄的巨大损失。我国野生葡萄资源丰富,其中野生毛葡萄‘丹凤-2’(Vitis qui... 详细信息

葡萄是世界范围内重要的栽培果树之一,对人类的经济、生态及社会产生了巨大的效益。葡萄白粉菌是严重危害葡萄产量和品质的一种真菌病害,造成了广泛栽培的欧洲葡萄的巨大损失。我国野生葡萄资源丰富,其中野生毛葡萄‘丹凤-2’(Vitis quinquangularis ***‘Danfeng-2’)对葡萄白粉病(Uncinula necator)有较强的抗性,为研究葡萄抗白粉病提供了材料。白藜芦醇是一种植保素,在植物受到真菌侵染、紫外线照射或处于病理状态时,诱导累积参与植物的防御反应。芪合成酶(stilbene synthase,STS)是白藜芦醇代谢中的关键酶,其表达受到了上游启动子序列的调控。因此,本文以中国野生毛葡萄‘丹凤-2’为研究材料,对芪合成酶基因VqSTS21、VqSTS30、VqSTS32和芪合成酶基因启动子Pro-VqSTS3、Pro-VqSTS6、Pro-VqSTS21、Pro-VqSTS31、Pro-VqSTS32和Pro-VqSTS33进行了表达分析研究,主要取得的结果如下:1克隆了中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因VqSTS21、VqSTS30、VqSTS32,其在GeneBank中的登录号分别为JQ868677、JQ868668、JQ868666。三个基因cDNA全长均为1179bp,编码392个氨基酸。半定量PCR(Semi-quanatitive RT-PCR)分析表明,VqSTS21、VqSTS30、VqSTS32基因在中国野生毛葡萄‘丹凤-2’与欧洲葡萄‘赤霞珠’不同组织根、茎、卷须、老叶、幼叶中呈现组成型表达的趋势,但VqSTS21、VqSTS30、VqSTS32基因的表达具有一定的组织特异性。2利用实时定量PCR(Real-time PCR)分析当受到植物激素ABA、SA和MeJA诱导和不同胁迫高温、低温和高盐处理时,在中国野生毛葡萄‘丹凤-2’与欧洲葡萄‘赤霞珠’中芪合成酶基因VqSTS21、VqSTS30、VqSTS32均能够诱导表达,各自的表达模式不同。3在白粉菌的诱导情况下,通过实时定量PCR分析了芪合成酶基因VqSTS21、VqSTS30、VqSTS32在中国野生毛葡萄‘丹凤-2’与欧洲葡萄‘赤霞珠’中的表达状况,结果表明VqSTS21、VqSTS30、VqSTS32均能够诱导表达,表达状况不同,其中除了VqSTS30外,VqSTS21和VqSTS32在中国野生毛葡萄‘丹凤-2’中的表达量大部分时间段均高于欧洲葡萄‘赤霞珠’中的表达。4通过农杆菌介导叶盘法将芪合成酶基因VqSTS21、VqSTS30、VqSTS32与植物表达载体pBI121融合的过量表达载体转入到烟草NC89中,通过PCR检测转基因植株,利用HPLC检测转基因植株中芪类物质的含量,结果表明,未检测到VqSTS21转基因植株中芪类物质的累积,只在VqSTS30和VqSTS32转基因植株中检测反式云杉新苷(trans-piceid)的存在,且反式云杉新苷在两者中的积累量差距不大,分别为26.087μg/g FW与26.371μg/g FW。5通过聚类分析,将根据GeneBank中已登录的32条中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因序列聚类为6个亚族,选取6个亚族中具有代表的芪合成酶基因启动子Pro-VqSTS3、Pro-VqSTS6、Pro-VqSTS21、Pro-VqSTS31、Pro-VqSTS32和Pro-VqSTS33,与本实验室改造的植物表达载体pCAMBIA0390::GUS融合,通过农杆菌介导的瞬时转化将其导入‘无核白’的叶片组织和体细胞胚,通过GUS蛋白活性定量分析表明,在瞬时转化含有6个目的芪合成酶基因启动子的‘无核白’叶片中GUS基因的表达活性有差异,而在体细胞胚无明显差异。

关键词：葡萄芪合成酶基因白藜芦醇启动子瞬时转化

芥蓝CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立

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芥蓝CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立

作者：郑爱红四川农业大学

学位级别：硕士

芥蓝(Brassica oleracea ***)属十字花科芸薹属蔬菜,其花薹和嫩叶中维生素C、类胡萝卜素、芥子油苷和多酚等营养物质含量丰富。ζ–胡萝卜素脱氢酶(ζ-carotene desaturase,ZDS)和八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase,PDS)是植物类... 详细信息

芥蓝(Brassica oleracea ***)属十字花科芸薹属蔬菜,其花薹和嫩叶中维生素C、类胡萝卜素、芥子油苷和多酚等营养物质含量丰富。ζ–胡萝卜素脱氢酶(ζ-carotene desaturase,ZDS)和八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase,PDS)是植物类胡萝卜素生物合成途径中重要的限速酶,ZDS和PDS基因分别被沉默后,转基因植株均会表现出明显的白化表型,因此这两个基因常作为CRISPR/Cas9基因编辑、VIGS等体系建立的报告靶基因。在CRISPR/Cas9基因编辑体系中,利用原生质体瞬转化技术筛选优良的CRISPR靶位点是一种高效精确的方法。我们前期研究发现,芥蓝中ZDS基因有一个成员,属单基因;而PDS基因有两个成员,属多基因。因此,本研究以芥蓝为试验材料,以BaZDS与BaPDSs基因为靶基因,首次建立了CRISPR/Cas9基因编辑技术在芥蓝中的原生质体瞬时转化体系、单基因与多基因编辑的稳定遗传体系。本研究的结果为芥蓝等芸薹属植物上利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究基因功能及新品种选育提供了理论基础和技术支撑。本研究主要结果如下:1.成功建立了芥蓝的CRISPR/Cas9原生质体瞬时转化体系,该体系可用于靶位点筛选。利用CRISPR-P在线软件在BaZDS基因的第1个外显子上选取1号靶位点,在第2个外显子上选取2号靶位点,分别构建pCC-BaZDS-sgRNA1和pCC-BaZDS-sgRNA2重组质粒。通过原生质体瞬时转化系统,转化pCC-BaZDS-sgRNA1载体后,分别培养24 h、36 h、48 h,结果表明培养48 h时转化效率最高,达92.6%,因此最佳的培养时间是48 h,进一步对突变情况检测分析发现,在该靶位点上的突变类型主要以大片段的缺失为主,占86.11%;转化pCC-BaZDS-sgRNA2载体后,发现在该靶位点上,突变率为54.8%,突变类型主要以2 bp的单碱基的替换突变为主,占38.71%,其次是1 bp碱基的插入突变。2.成功建立了芥蓝单基因的CRISPR/Cas9稳定遗传体系。通过农杆菌介导的遗传转化方法,转化pCC-BaZDS-sgRNA1载体,共获得了19个转基因阳性植株,转基因阳性率为95%,其中发生突变的有13株,突变效率为68.42%,突变类型主要以大片段的插入为主,占26.32%;其次是单碱基的替换突变,且所有的突变植株均表现出明显的白化表型。3.成功建立了芥蓝多基因的CRISPR/Cas9稳定遗传体系,CRISPR/Cas9系统在芥蓝中具有同时编辑多个基因的能力。利用CRISPR-P在线软件,分别在BaPDS1和BaPDS2基因的第4个外显子上选取了两个基因的共同靶位点,合成靶序列,构建pCC-BaPDS-sgRNA重组质粒。通过农杆菌介导的遗传转化方法,共获得了68个转基因阳性植株,转基因阳性率是90.76%。突变分析发现,突变率为76.47%,其中BaPDS1、BaPDS2双突出现的比例约为1/5,单突比例超过一半,突变类型均是以短核苷酸的变化为主,没有大于10 bp的碱基的突变发生,且突变植株产生了明显的白化表型。

关键词：芥蓝 CRISPR/Cas9 原生质体瞬时转化稳定遗传转化 ζ–胡萝卜素脱氢酶八氢番茄红素脱氢酶

柑橘中性神经酰胺酶基因NCER2在丛枝菌根共生中的作用研究

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柑橘中性神经酰胺酶基因NCER2在丛枝菌根共生中的作用研究

作者：郑紫君华中农业大学

学位级别：硕士

柑橘根系根毛稀少,主要依靠与丛枝菌根真菌形成菌根来吸收水分和矿质营养。丛枝菌根共生还能够提高柑橘在生物和非生物胁迫下的抵抗能力,因此研究柑橘菌根共生形成的分子机制具有重要意义。实验室前期转录组研究发现柑橘常用砧木枳的神... 详细信息

柑橘根系根毛稀少,主要依靠与丛枝菌根真菌形成菌根来吸收水分和矿质营养。丛枝菌根共生还能够提高柑橘在生物和非生物胁迫下的抵抗能力,因此研究柑橘菌根共生形成的分子机制具有重要意义。实验室前期转录组研究发现柑橘常用砧木枳的神经酰胺酶基因CsNCER2在接种丛枝菌根真菌后显著上调表达,说明该基因可能参与丛枝菌根共生。本课题旨在通过生物信息学,启动子-GUS,RNAi等技术手段研究CsNCER2基因及其苜蓿同源基因MtNCER2在丛枝菌根共生过程中的表达及功能,为下一步柑橘菌根功能研究奠定基础。论文研究结果如下:***基因家族系统进化分析表明,CsNCER2在进化树中与苜蓿等菌根植物的同源基因聚在同一分支上,且该分支上没有非菌根植物,表明该菌根植物特异分支可能与菌根共生相关。不同植物的NCER氨基酸序列比对结果表明,植物中NCER的GDVSPN六肽功能结构域在进化上是高度保守的。而菌根植物特异分支中的NCER蛋白中该保守结构域的丝氨酸位点发生了改变,推测保守位点的改变可能影响了NCER的部分功能,使菌根植物特异分支中的NCER蛋白区别于非特异分支的NCER蛋白,从而在菌根共生中发挥作用。2.实验室前期转录组数据分析表明CsNCER2基因在接种丛枝菌根真菌后表达量显著上调,而另外两个同源基因表达水平无明显变化。本研究通过qRT-PCR检测出蒺藜苜蓿中的同源基因MtNCER2也在接种丛枝菌根真菌后显著上调表达。通过苜蓿瞬时转化体系对MtNCER2进行启动子-GUS分析,表明GUS活性在不接种丛枝菌根真菌时不表达,接种丛枝菌根真菌后GUS活性富集于根系内皮层的丛枝细胞中,具有组织特异性。3.本课题利用已建立的苜蓿瞬时转化体系对MtNCER2进行快速的RNAi功能分析。qRT-PCR检测发现,相比对照组,干涉植株中MtNCER2表达量下降了约75%,与菌根侵染和丛枝形成与发育相关的Marker基因MtPT4、MtEXO70I、RiEF均显著下调。结果表明MtNCER2干涉效率较高,干涉MtNCER2基因可能影响了菌丝生长发育及丛枝形成。进一步的观察及共生情况统计表明,干涉MtNCER2基因导致丛枝菌根真菌的侵染率(F%)降低,但菌丝在根内的生长和丛枝形态发育均不受影响。本研究推测MtNCER2基因作用于共生形成的早期阶段,参与根外菌丝在根系表面的附着或入侵过程。

关键词：丛枝菌根共生 NCER 柑橘瞬时转化苜蓿