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清瘟解热合剂抗甲型流感病毒活性及分子机制研究

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清瘟解热合剂抗甲型流感病毒活性及分子机制研究

作者：张玲昆明理工大学

学位级别：硕士

流行性感冒(简称“流感”)是由流感病毒感染引起的一种急性呼吸道传染病。据世界卫生组织估计,全球每年有近10%的人口感染流感病毒,导致约20-50万人死亡。在已发现的4类流感病毒中,甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是临床上最重要... 详细信息

流行性感冒(简称“流感”)是由流感病毒感染引起的一种急性呼吸道传染病。据世界卫生组织估计,全球每年有近10%的人口感染流感病毒,导致约20-50万人死亡。在已发现的4类流感病毒中,甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是临床上最重要的病原体之一。自20世纪以来,全球爆发了多次IAV大流行,如1918的“西班牙流感”、2009年的“猪流感”等,对公共卫生造成极大威胁。研究发现,IAV感染可引起TLRs/NF-κB等信号通路激活,诱导炎症因子大量表达甚至导致细胞因子风暴发生,这可能是流感病毒感染引起重症肺炎的致病机制之一。抗病毒药物是对抗流感病毒感染的有效手段,以金刚烷为代表的M2离子通道抑制剂、以奥司他韦为代表的NA抑制剂(NAIs)和以Baloxavir marboxil为代表的RNA聚合酶抑制剂是流感治疗中使用较为广泛的小分子靶向药物,它们可以改善H1N1、H5N1和H7N9等流感患者的症状和预后。然而,越来越多的研究表明,多个流行毒株对这些药物产生耐药性,且部分患者因此产生严重后遗症甚至死亡。我国使用中医药治疗流感已有几千年的历史,例如银翘散、麻杏石甘汤等,它们具有成分众多、靶点众多、不易产生耐药性等优势,但大多数抗病毒中药的作用机制尚不明确。清瘟解热合剂(Qingwenjiere Mixture,QJM)是云南省中医医院温伟波院长基于“瘟疫防治理论”而研制的中药复方制剂,对新冠肺炎患者和流感患者具有良好的临床治疗效果。本实验室课题组前期研究发现,QJM对SARS-Co V-2和3种感染人的普通冠状病毒具有广谱抗病毒活性及抗炎活性。然而,QJM对IAV的治疗机理尚不清楚。本研究旨在阐明QJM在体内和体外水平抗IAV活性、抗炎活性以及抗IAV作用机理,以期为临床应用QJM治疗流感提供理论参考。首先,对QJM体外抗IAV药效进行研究。本论文构建了甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)(PR8)和A/duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)(Y280)感染犬肾细胞系(MDCK)模型,病毒感染可引起细胞变圆、皱缩等,病毒复制水平随时间增加而升高。以连花清瘟提取物(Lianhua Qingwen,LH)和磷酸奥司他韦(Oseltamivir Phosphate,OSE)为阳性对照药物,分别检测QJM、LH和OSE在MDCK细胞中的半数细胞毒性浓度(CC)、和半数抑制浓度(IC)和药物选择指数(SI)。结果发现QJM对MDCK的CC值为6.33±0.25 mg/m L,QJM对PR8和Y280的IC值分别为0.33±0.009 mg/m L和0.65±0.007 mg/m L,其SI值分别为19±1.26和9.6±0.51,表明QJM对IAV低毒高效。通过空斑实验和血凝抑制实验检测发现QJM具有抑制IAV增殖的效果。为了明确QJM的作用阶段,在病毒感染前和感染后0、2、4、6和8 h进行QJM(2 mg/m L)治疗,通过病毒滴度检测发现QJM主要作用于病毒复制的早期阶段(0-4 h)。在IAV复制早期,其正链RNA需要病毒核蛋白(Nucleoprotein,NP)包被才能合成新的v RNA,因此在6 hpi和8 hpi对NP进行亚细胞定位分析。在病毒感染细胞中,NP在细胞核和细胞质中大量表达;在QJM作用后,NP表达量降低且该蛋白被限制在细胞核内,提示QJM可具有抑制NP蛋白核输出的活性。此外,实时荧光定量PCR(q PCR)检测发现,病毒感染可上调TNF-α、IL-6、IL-1α、IFN-γ、TRAIL和RANTES等炎症因子m RNA表达水平,QJM可显著抑制上述炎症因子表达(P流感小鼠模型进行QJM抗IAV体内药效评价。PR8毒株通过滴鼻感染BALB/c小鼠,测得其LD为10PFU/m L。利用10LD进行感染,结果发现小鼠在8 dpi时全部死亡,且肺病理观察到小鼠肺部产生了严重病变,TCID方法测定肺组织中病毒滴度约为10TCID/0.1 m L。本研究通过死亡保护实验,发现QJM高剂量组(17 g/kg/d)可以显著提高感染小鼠的存活率(71.25%,P病毒滴度和肺指数等进行检测,QJM高剂量组(17 g/kg/d)可以显著抑制病毒的复制(P<0.01),降低肺指数(P<0.05)。通过ELISA检测肺炎症因子的分泌水平以及通过HE染色进行组织病理分析,发现QJM可以降低TNF-α、IL-6、TRAIL和IP-10炎症因子的分泌,减少肺组织中炎性细胞、中性粒细胞浸润程度,改善肺出血、肺气肿和弥漫性肺损伤等病理特征。该部分研究表明QJM在动

关键词：甲型流感病毒细胞因子风暴清瘟解热合剂先天免疫 NF-κB

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靶向甲型流感病毒广谱单克隆抗体的初步研究

靶向甲型流感病毒广谱单克隆抗体的初步研究

作者：陈楠河南大学

学位级别：硕士

甲型流感病毒(Influenza Virus A,IVA)是一种高度传染性的呼吸道病原体,由于缺乏有效的控制方法,对全球公共卫生构成重大威胁。血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)是位于甲型流感病毒囊膜表面的重要糖蛋白,根据HA... 详细信息

甲型流感病毒(Influenza Virus A,IVA)是一种高度传染性的呼吸道病原体,由于缺乏有效的控制方法,对全球公共卫生构成重大威胁。血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)是位于甲型流感病毒囊膜表面的重要糖蛋白,根据HA和NA抗原的不同,目前发现的IVA HA有18个亚型,NA有11个亚型。HA主要负责与宿主细胞唾液酸残基结合,并实现病毒和细胞膜的融合,是病毒中和抗体的主要靶标。NA具有唾液酸酶活性,负责水解细胞表面末端的唾液酸残基,促进新生病毒的释放,也是流感治疗的重要靶抗原。本研究利用噬菌体表面展示技术,筛选获得抗甲型流感病毒表面蛋白HA和NA(N1亚型)的广谱抗体,并对其进行功能评价,主要包括以下两方面:1.靶向甲型流感病毒HA蛋白广谱抗体的功能评估基于课题组前期工作,通过噬菌体库筛选技术获得1株具有多种亚型HA蛋白结合活性的单链抗体(single-chain antibody fragment,sc Fv)FHA3,并依据此sc Fv序列信息,PCR扩增抗体的轻重链可变区序列,将其连入表达载体,构建了重组质粒pFRT-Ig G1κ-FHA3。利用瞬时高效表达系统Expi CHO细胞以及亲和纯化技术制备得到抗体蛋白FHA3。经ELISA实验,我们证实FHA3与甲型流感病毒H1N1 HA、H2N2 HA、H3N2 HA、H5N1 HA、H7N9 HA以及H9N2 HA均识别结合,且呈浓度依赖效应。抗体中和实验检测到FHA3具有较好的体外中和活性,在低浓度下能有效阻断H1N1、H5N1以及H7N9假病毒入侵靶细胞。接下来,我们建立起了一种基于H5N1假病毒的小鼠体内感染可视化模型,并将该模型用于评估FHA3的体内保护活性。在预防性保护实验中,FHA3表现出体内中和活性,可以降低假病毒对小鼠的感染。综上所述,FHA3具有良好的体内外中和活性。2.靶向甲型流感病毒N1亚型NA蛋白抗体的筛选及鉴定本部分我们通过计算机分子模拟技术,借助检索获得的抗体序列可变区为模板,设计了针对N1亚型NA蛋白的抗体库。利用噬菌体表面展示技术,以甲型流感病毒H1N1NA为靶抗原,经过“吸附-洗脱-感染”循环式的筛选,获得了一株具有结合活性的单链抗体FNA1。将合成的抗体重链以及轻链可变区序列依次连接入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-Ig G1κ上,构建重组表达质粒。将表达质粒瞬时转染入高效表达系统Expi CHO细胞中,收集细胞培养上清,利用Protein A亲和纯化技术纯化培养上清中的抗体蛋白FNA1。通过ELISA、WB和流式细胞术检测FNA1与NA亚型蛋白的结合,发现其特异性识别结合N1亚型(H1N1、H5N1)的NA抗原。ELLA和NA-XTD实验结果显示,FNA1可能是结合到NA酶活性位点附近通过空间位阻来抑制其唾液酸酶活性。假病毒感染实验进一步证实,FNA1在低浓度下(5μg/m L)即能有效阻断新包装的H5N1假病毒颗粒从细胞表面释放,体外抑制假病毒的扩散。接下来选取H1N1 NA蛋白上的35个位点进行定点突变,检测FNA1与各NA突变蛋白的结合。结果显示,35个突变蛋白中,FNA1丧失了与4个突变蛋白mutant15(W219A)、mutant21(K254A)、mutant31(W358A)、mutant33(S388A)的结合,提示W219、K254、W358以及S388是FNA1识别H1N1 NA蛋白的关键表位。至此,我们获得了一株抗N1亚型神经氨酸酶的单克隆抗体,并验证了该抗体的体外结合活性和NA抑制活性。

关键词：甲型流感病毒广谱单克隆抗体血凝素神经氨酸酶

小分子化合物UCM05抑制H1N1甲型流感病毒复制的机制及其广谱抗病毒作用研究

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小分子化合物UCM05抑制H1N1甲型流感病毒复制的机制及其广谱抗病...

作者：朱榕榕南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景:甲型和乙型流感病毒感染引起的季节性流感导致全球卫生经济负担沉重。虽然在SARS-CoV-2出现后季节性流感病毒的传播在2020-2021年有所下降,但2022年感染率又有卷土重来的趋势。针对流感病毒,疫苗预防是首要选择。然而RNA依赖性... 详细信息

研究背景:甲型和乙型流感病毒感染引起的季节性流感导致全球卫生经济负担沉重。虽然在SARS-CoV-2出现后季节性流感病毒的传播在2020-2021年有所下降,但2022年感染率又有卷土重来的趋势。针对流感病毒,疫苗预防是首要选择。然而RNA依赖性RNA聚合酶的高误差率以及合并感染中RNA片段的重组为甲型流感病毒提供了进化能力,使疫苗受“时效性”限制无法更高效的抑制病毒传播。除疫苗之外,抗病毒药物在预防和治疗流感病毒感染方面发挥着至关重要的作用。目前FDA批准两种治疗流感的药物为M2离子通道抑制剂和NA抑制剂。然而甲型流感病毒对M2离子通道抑制剂存在广泛耐药性,研究者将眼光投向新靶点抗病毒药物的开发。网格蛋白依赖性的内吞途径是流感病毒进入宿主细胞的途径之一。网格蛋白包裹物质形成囊泡,是细胞内神经传递、信号转导和许多质膜活动调节的基础。糅花单宁类似物UCM05,一种脂肪酸合成酶抑制剂,研究发现能够抑制人类乳腺癌细胞系的增殖。在前期细胞实验中,我们进行基于蛋白水平的抗病毒筛选,发现了 UCM05具有抗甲型流感病毒的能力,可能对新型抗流感病毒药物的研发提供新思路。研究目的:本文通过研究小分子化合物UCM05抑制甲型流感病毒活性实验,探究其作用机制,以期寻找抗流感病毒新靶点药物,为开发新型抗流感病毒药物提供新的思路。研究方法:1.MTT法检测UCM05对MDCK、A549、Beas-2B细胞的细胞毒性及其抗病毒活性,CPE法检测对细胞的保护作用;2.通过Western blotting实验、qRT-PCR实验以及间接免疫荧光实验在蛋白和mRNA水平上检测UCM05对甲型流感病毒的抑制作用;3.通过H5N1假病毒抑制实验、血凝抑制实验、NA抑制实验、mini-replicon实验检测UCM05抑制甲型流感病毒的作用阶段;4.通过融合前抑制实验、吸附抑制实验、转铁蛋白及小窝蛋白吸收抑制实验、免疫共聚焦实验检测UCM05抑制甲型流感病毒的作用靶点;5.小鼠实验检测UCM05体内抗甲型流感病毒作用;6.通过MTT实验、Western blotting实验、qRT-PCR实验等检测UCM05对寨卡病毒、疱疹病毒、冠状病毒以及SARS-CoV-2假病毒的抑制活性。实验结果:1.UCM05在MDCK、A549、Beas-2B细胞上具有抑制甲型流感病毒效果,减少子代病毒的载量;2.UCM05可抑制假病毒的进入,但对凝血现象无抑制作用,且对神经氨酸酶无抑制作用,对RNA聚合酶无明显抑制作用。在病毒感染细胞0-2 h抑制活性最强;3.UCM05可以抑制转铁蛋白的吸收,对小窝蛋白无明显抑制效果;4.UCM05对流感病毒引起的小鼠体内病毒性肺炎的症状有所改善,降低肺组织内相关炎症因子的水平。5.UCM05 对 ZIKV、HSV-1/2、HCoV-OC43 具有一定抑制活性,对以及 SARS-CoV-2假病毒进入也有抑制效果。实验结论:UCM05能够在体内外抑制甲型流感病毒感染。其主要作用于病毒入侵宿主的进入阶段,通过抑制网格蛋白依赖性内吞途径抑制病毒的增殖,对小窝蛋白无明显抑制效果。同时UCM05具有潜在的广谱性抗病毒活性。

关键词：进入抑制剂甲型流感病毒 UCM05 广谱抗病毒活性

甲型流感病毒蛋白和遗传物质在宿主细胞质内顺向转运过程及其机制

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生物工程学报 2012年第9期28卷 1021-1030页

作者：池晓娟王松黄一帆陈吉龙福建农林大学动物科学学院动物医学系福建福州350002 中国科学院微生物研究所中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室北京100101

流感病毒的蛋白和基因组在宿主细胞内能否正确地转运到相关部位,直接影响到病毒颗粒的形态发生。流感病毒跨膜蛋白(HA、NA和M2)主要通过宿主细胞的运输膜泡实现转运,而宿主细胞的蛋白转运机器参与了这一过程。新合成的流感病毒核糖核蛋... 详细信息

流感病毒的蛋白和基因组在宿主细胞内能否正确地转运到相关部位,直接影响到病毒颗粒的形态发生。流感病毒跨膜蛋白(HA、NA和M2)主要通过宿主细胞的运输膜泡实现转运,而宿主细胞的蛋白转运机器参与了这一过程。新合成的流感病毒核糖核蛋白复合物(vRNPs)出核后,通过与活化的Rab11相结合,聚集于邻近微管组织中心(MTOC)的胞内体。然后以运输小膜泡的形式,沿着MTOC的微管网络向细胞膜方向转运。跨膜蛋白和基因组在细胞质内的转运受一些宿主因子的调控,如ARHGAP21和小G蛋白Cdc42能够调节NA蛋白向细胞膜转运,Rab11协助vRNPs从MTOC向细胞膜转运。文中主要讨论新合成的流感病毒跨膜蛋白和遗传物质在宿主细胞质内的顺向转运(Anterograde transport)过程与调控。

关键词：甲型流感病毒跨膜蛋白基因组宿主因子顺向转运

小槐花提取物对甲型H1N1流感病毒感染的体外抑制作用

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吉林农业大学学报 2024年第1期46卷 148-154页

作者：徐国双金新郭艺迪张茂林段铭关振宏吉林大学人兽共患病研究所人兽共患病教育部重点实验室长春130062

采用CCK8法测定小槐花提取物在MDCK细胞上的最大安全浓度(Maximum no-cytotoxic concentration,MNTC);建立甲型流感病毒A/PR8/34(H1N1,PR8)感染MDCK细胞模型,CCK8法检测其对病毒感染细胞病变的抑制作用;利用荧光定量PCR及免疫印迹方法,... 详细信息

采用CCK8法测定小槐花提取物在MDCK细胞上的最大安全浓度(Maximum no-cytotoxic concentration,MNTC);建立甲型流感病毒A/PR8/34(H1N1,PR8)感染MDCK细胞模型,CCK8法检测其对病毒感染细胞病变的抑制作用;利用荧光定量PCR及免疫印迹方法,检测小槐花提取物对流感病毒基因、蛋白,以及宿主炎症相关转录因子和炎性细胞因子表达的影响。细胞毒性试验结果显示,小槐花提取物对MDCK细胞的MNTC为100 mg/L;qRT-PCR结果显示,小槐花提取物能显著抑制PR8流感病毒M与NP基因的mRNA表达(P病毒感染细胞的转录因子NF-κB p65、STAT3及炎性细胞因子IL-1β、TNF-α基因的表达水平,且其抑制作用与药物浓度正相关;免疫印迹法检测显示,100 mg/L的小槐花提取物极显著抑制了流感病毒M1蛋白的表达(P流感病毒效果,此研究结果为从小槐花中鉴定具有抗流感病毒的确切药效成分奠定基础。

关键词：甲型流感病毒小槐花提取物 CCK8 抗病毒活性炎性细胞因子

甲型流感病毒PB1-PA蛋白作用位点的发现与分析

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中山大学学报（自然科学版） 2011年第2期50卷 81-86页

作者：何淼林强乾赵艳超张淑波陈维田中山大学生命科学学院广东广州510275 香港理工大学屋宇设备工程系

基于共进化理论,探究了甲型流感病毒PB1蛋白与PA蛋白上具有共同进化可能性的保守九聚片段(C9MP)。结构信息显示PB1蛋白的第1-15位氨基酸与PA蛋白的第239-716位氨基酸具有相互作用域;对该区域变异分布的分析发现,PA蛋白第670位氨基酸Q所... 详细信息

基于共进化理论,探究了甲型流感病毒PB1蛋白与PA蛋白上具有共同进化可能性的保守九聚片段(C9MP)。结构信息显示PB1蛋白的第1-15位氨基酸与PA蛋白的第239-716位氨基酸具有相互作用域;对该区域变异分布的分析发现,PA蛋白第670位氨基酸Q所在的C9MP与PB1蛋白的第9位氨基酸F、第12位氨基酸V和第13位氨基酸P所在的C9MP在PB1MP1相互作用面上具有最低的共进化值。结合DSSP程序的分析表明,由PA蛋白第670位氨基酸Q与PB1蛋白的第9位氨基酸F、第12位氨基酸V与第13位氨基酸P构成的区域可能成为潜在的相互作用位点。

关键词：共进化理论甲型流感病毒 PB1蛋白 PA蛋白相互作用位点

甲型流感病毒分类与通用流感疫苗及广谱中和活性抗体的研究

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复旦学报（医学版） 2011年第6期38卷 476-480页

作者：蒋露芳居丽雯姜庆五复旦大学公共卫生学院卫生微生物教研室-公共卫生安全教育部重点实验室上海200032

流感是对人类危害极大的传染病,疫苗接种被认为是预防流感的最有效手段。为解决流感病毒变异导致现有疫苗时效性与有效性的问题,研制能够预防所有流感病毒毒株、可诱导持久保护性免疫的通用流感疫苗一直是流感研究的热点,同时,能中和所... 详细信息

流感是对人类危害极大的传染病,疫苗接种被认为是预防流感的最有效手段。为解决流感病毒变异导致现有疫苗时效性与有效性的问题,研制能够预防所有流感病毒毒株、可诱导持久保护性免疫的通用流感疫苗一直是流感研究的热点,同时,能中和所有甲型流感病毒的广谱中和活性抗体的研究也已成为目前关注的重点,因此对甲型流感病毒分类研究也提出了相应的要求。

关键词：甲型流感病毒分类通用流感疫苗中和抗体

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甲型流感病毒纯化及病毒生物学特征分析

西安交通大学学报（医学版） 2016年第6期37卷 897-900页

作者：刘杨赵向绒郭春艳胡军余鹏博陕西省人民医院中心实验室陕西西安710068 西安交通大学医学部第三附属医院陕西西安710068 陕西省疾病预防控制中心病毒所陕西西安710054

目的评价蔗糖密度梯度离心纯化甲型流感病毒的方法,并对纯化的病毒颗粒特征和免疫原性进行分析。方法接种鸡胚培养病毒,收获尿囊液,超速离心浓缩,蔗糖密度梯度离心纯化病毒,用血凝试验、蛋白定量、透射电镜和SDS-PAGE鉴定病毒颗粒。取... 详细信息

目的评价蔗糖密度梯度离心纯化甲型流感病毒的方法,并对纯化的病毒颗粒特征和免疫原性进行分析。方法接种鸡胚培养病毒,收获尿囊液,超速离心浓缩,蔗糖密度梯度离心纯化病毒,用血凝试验、蛋白定量、透射电镜和SDS-PAGE鉴定病毒颗粒。取病毒纯化产物以0.03mg/只和0.005mg/只分组免疫小鼠,采集小鼠血清,利用血凝抑制试验测定血清血凝抑制滴度。结果成功利用蔗糖密度梯度离心法纯化出流感病毒,病毒原液经纯化后被分离成L、M、H三个病毒带,其中M病毒带的吸光度、蛋白浓度及血凝滴度最高,蛋白浓度可达1.2mg/mL,血凝滴度高达1×49。电镜观察显示,L区带为具有血凝活性的质膜和结构疏松的病毒组成,M区带病毒颗粒呈球形、丝状或棒状。同时,有大量空心病毒颗粒存在。H区带与M区带类似,但未发现空心病毒颗粒。纯化的病毒免疫小鼠后可产生具有较高血凝抑制活性的抗体。结论蔗糖密度梯度离心技术可用于流感病毒抗原的制备,且不影响病毒的免疫原性。因此,密度梯度离心法可为流感病毒的基础研究及疫苗开发提供技术支持。

关键词：甲型流感病毒蔗糖密度梯度超速离心免疫原性

SARS-CoV-2和甲型流感病毒H3N2双价重组腺病毒载体疫苗的构建及免疫原性研究

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SARS-CoV-2和甲型流感病毒H3N2双价重组腺病毒载体疫苗的构建及免...

作者：韩頔内蒙古医科大学

学位级别：硕士

目的评价一种SARS-Co V-2 Beta变异株和甲型流感病毒H3N2新型重组双价疫苗在小鼠模型中的免疫保护效果。方法1.HAd V5-S1-2A-HA的构建本研究构建了表达SARS-Co V-2南非变异株(B.1.351)棘突蛋白1(S1)和H3N2柬埔寨分离株(A/Cambodia/e0826... 详细信息

目的评价一种SARS-Co V-2 Beta变异株和甲型流感病毒H3N2新型重组双价疫苗在小鼠模型中的免疫保护效果。方法1.HAd V5-S1-2A-HA的构建本研究构建了表达SARS-Co V-2南非变异株(B.1.351)棘突蛋白1(S1)和H3N2柬埔寨分离株(A/Cambodia/e0826360/2020)血凝素(HA)的重组双价非复制Ad5载体疫苗,命名为HAd V5-S1-2A-HA。重组后进行了病毒的扩增、纯化、滴定、体外表达验证。2.免疫与攻毒方案1)HAd V5-S1-2A-HA疫苗经单针肌肉注射(I.M.)免疫BALB/c雌性小鼠两周后,采用ELISA、血凝抑制实验(HI)、假病毒中和实验与ELISPOT实验,对低剂量组(1×10～8vp/只)、高剂量组(5×10～9vp/只)和对照组(Mock)小鼠进行体液与细胞免疫学检测,免疫后3～6周采用H3N2-X31、H1N1-PR8与SARS-Co V-2(B.1.351)病毒对高剂量组和对照组进行攻毒保护实验。2)HAd V5-S1-2A-HA疫苗经单针滴鼻(I.N.)免疫BALB/c雌性小鼠两周后,采用ELISA、血凝抑制实验(HI)、假病毒中和实验与ELISPOT实验,对高低剂量组和对照组进行体液与细胞免疫学检测。免疫后3周采用H3N2-X31与H1N1-PR8病毒对高低剂量组和对照组进行攻毒保护实验。免疫后4周采用SARS-Co V-2(B.1.351)病毒对高剂量组和对照组进行攻毒保护实验。3)经单针肌肉注射(I.M.)免疫的低剂量组BALB/c雌性小鼠,第3周使用滴鼻(I.N.)进行加强免疫;经单针滴鼻(I.N.)免疫的高低剂量组小鼠,第4周使用肌肉注射(I.M.)进行加强免疫,加强免疫剂量均为5×10～9vp/只。加强免疫后两周,采用ELISA、血凝抑制实验(HI)、假病毒中和实验与ELISPOT实验进行体液、黏膜与细胞免疫学检测。针对初免肌注低剂量-滴鼻加强(I.M.1×10～8vp+I.N.)的疫苗接种组小鼠,加强后3周用H3N2-X31与H1N1-PR8病毒进行攻毒保护实验,加强后4周用SARS-Co V-2(B.1.351)病毒进行攻毒保护实验。结果1.HAd V5-S1-2A-HA疫苗经单针肌肉注射(I.M.)免疫后,低剂量组的小鼠可以检测到HA特异的体液免疫与S1特异的细胞免疫应答;而高剂量组诱导产生了较强的双抗原(S1、HA)特异的体液和细胞免疫反应,并能完全保护小鼠对H3N2-X31的攻击,降低SARS-Co V-2(B.1.351)感染后小鼠肺部病毒载量,延迟H1N1-PR8病毒感染后小鼠死亡的发生。2.HAd V5-S1-2A-HA疫苗经单针滴鼻(I.N.)免疫后,低剂量组小鼠几乎无法检测出双抗原(S1、HA)特异的体液和细胞免疫反应;高剂量组可以诱导产生双抗原(S1、HA)特异的体液和细胞免疫反应,几乎完全保护小鼠对H3N2-X31的攻击,降低SARS-Co V-2(B.1.351)感染后小鼠肺部病毒载量,延迟H1N1-PR8病毒感染后小鼠死亡的发生。3.加强免疫后,双抗原(S1、HA)特异的体液和细胞免疫应答均显著增强。其中,初免低剂量肌注-加强滴鼻(I.M.1×10～8vp+I.N.)联合免疫方案能够完全保护小鼠对H3N2-X31的攻击,降低SARS-Co V-2(B.1.351)感染后小鼠肺部病毒载量,延迟H1N1-PR8病毒感染后小鼠死亡发生的时间,并且超过单针免疫后小鼠死亡发生的时间。结论本研究构建的重组双价疫苗HAd V5-S1-2A-HA在小鼠中诱导抗原特异的体液、黏膜与细胞免疫应答。不同联合免疫方案中抗原特异的体液与细胞免疫应答均显著增强。实现小鼠针对于SARS-Co V-2和H3N2感染的免疫保护。为了避免Ad5预存抗体对免疫应答的影响,本研究设计了不同的免疫方案。因此,HAd V5-S1-2A-HA疫苗具有较好的研发与应用前景。

关键词：新型冠状病毒甲型流感病毒腺病毒载体疫苗棘突蛋白1 血凝素免疫保护