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王浆主蛋白作为胎牛血清替代物培养中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1的效果及作用机制

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2018年第1期44卷 1-9页

作者：钱浩诚蒋晨旻陈华才沈立荣浙江大学生物系统工程与食品科学学院馥莉食品科学研究院浙江省农产品加工技术研究重点实验室杭州310058 中国计量大学光学与电子科技学院杭州310018

用王浆主蛋白(major royal jelly proteins,MRJPs)部分代替胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)培养中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO-K1),比较添加不同MRJPs/FBS(M/F)比例的培养基对细胞相对增殖率的影响。四唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)结果显示:当M/F比例为50/50时对细胞的促增殖作用最显著;与完全培养基对照组(M/F 0/100)相比,培养48与72 h时的相对活细胞数分别上升了25.1%和13.6%。细胞成像仪分析表明,M/F 50/50培养基的细胞密度最高,其细胞直径显著大于完全培养基对照组。流式细胞仪结果显示,与完全培养基对照组相比,M/F 50/50培养基中的细胞增殖指数(proliferation index,PI)提高了19.4%,推测MRJPs的促细胞增殖作用可能与DNA、蛋白质及酶的合成有关。拉曼光谱检测结果显示,各处理组培养基的细胞光谱图之间没有显著差异,说明MRJPs在促进细胞增殖的同时维持了细胞的稳定性。以上结果证明,MRJPs可以部分替代FBS培养生物医药产业中应用广泛的CHO-K1细胞,降低细胞培养成本,具有产业化前景,并为蜂王浆深加工提供新的用途。

关键词：王浆主蛋白中国仓鼠卵巢细胞胎牛血清促增殖细胞周期拉曼光谱

王浆主蛋白MRJP-1分离测定及对细胞的促生长作用研究

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王浆主蛋白MRJP-1分离测定及对细胞的促生长作用研究

作者：柳丹丹浙江大学

学位级别：硕士

蜂王浆是蜂群中5-15日龄期哺育工蜂咽下腺、上颚腺和脑后腺等腺体的分泌物,它调控着蜜蜂生长发育过程中的级型分化,并对人体具有营养保健功能。近年来,蜂王浆蛋白和多肽成为科学家们关注的热点,其中王浆主蛋白1（MRJP-1）是蜜蜂级型分... 详细信息

蜂王浆是蜂群中5-15日龄期哺育工蜂咽下腺、上颚腺和脑后腺等腺体的分泌物,它调控着蜜蜂生长发育过程中的级型分化,并对人体具有营养保健功能。近年来,蜂王浆蛋白和多肽成为科学家们关注的热点,其中王浆主蛋白1（MRJP-1）是蜜蜂级型分化关键因子的最新发现,使王浆主蛋白（MRJPs）和MRJP-1的研究成为研究热点。本文研究MRJPs、MRJP-1的提取、营养功能和应用前景。主要研究结果如下： 1) MRJPs、MRJP-1的提取分离用离心透析方法制备MRJPs冻干粉。取鲜王浆溶液,经抽提、离心、取上清、冻干,得到MRJPs粗蛋白冻干粉,其蛋白得率为鲜王浆的7.34%。经SDS-PAGE分析,MRJPs含4条蛋白条带,由文献推测为：77-87kDa MRJP-5、0-70kDa MRJP-3、57kDa MRJP-1和49kDa MRJP-2。用超速离心法分离制备MRJP-1.将鲜王浆稀释,超速离心两次、取胶状沉淀,即为MRJP-1,其得率约为鲜王浆的3.21%。SDS-PAGE电泳分析表明,部分MRJP-1仍残留于王浆上清液中,分离得到的MRJP-1为单一蛋白质,分子量约57kDa。 2) MRJP-1特异性多克隆抗体制备用化学合成多肽制备MRJP-1特异性多克隆抗体。首先,采用生物信息软件,对MRJPs家族（MRJP-l-MRJP-9）作氨基酸序列同源性分析,从MRJP-1氨基酸全序列中筛选出其不同于该家族其他成员（MRJP-2-MRJP-9）的特异性序列,用化学法合成该多肽;然后用合成多肽免疫兔子,取兔血清,经过用亲和层析法纯化,得到特异性多克隆抗体（R2）。 Western blot结果显示,MRJP-1抗体R2能专一性地识别蜂王浆主蛋白MRJP-1。经Elisa测定,其效价大于1：20000。而用重组大肠杆菌表达的MRJP-1全序列蛋白制备的抗体（R1）,只能特异性地识别MRJPs家族蛋白,而不能专一性地识别MRJP-1,其Elisa效价大于1：10000,活性只有为前者的1/2。 3)蜂王浆中MRJP-1含量的Elisa法测定用Elisa去测定蜂王浆中MRJP-1含量。以MRJP-1特异性抗体R2为一抗,以超速离心法制备的MRJP-1为标准蛋白（抗原）作倍比稀释,采用Elisa（?）检测不同浓度MRJP-1蛋白样品的吸光度450nm-630nm,建立吸光度与MRJP-1蛋白浓度间的标准曲线。将MRJPs冻干粉稀释,作为抗原,同样条件下测定获得样品吸光度,代入所建标准曲线,结果显示新蜂王浆含MRJP-13.85%。而R1作为一抗可与所有MRJPs家族成员发生交叉反应,不具备特异性,只能用于MRJPs的定量测定,因此Elisa法测定得到的结果显著高于R2为一抗的测定结果。该方法操作简单,方便迅速,成本低廉,可用于测定显示蜂王浆质量的标志性蛋白MRJP-1,作为判断蜂王浆质量的主要依据。 4) MRJPs、MRJP-1对细胞的促生长作用研究通过MRJPs、MRJP-1替代牛血清培养细胞实验,观察MRJPs、MRJP-1对spc-A-1、 sw480、sw620、293T、Hepli4、HCT-116和A2780等7个细胞株形态和生长、分裂的影响。结果显示：①MRJPs、MRJP-1（?）部分代替FBS用于细胞培养,但活性低于FBS。两者对spc-A-1、sw480、sw620、93T、Hepli4细胞均有一定的促进生长和分裂活性,能不同程度地促进部分细胞生长分裂、维持细胞正常形态。②MRJPs、MRJP-1对细胞的促生长活性有一定的选择性和范围,如对HCT-116细胞和A2780细胞没有活性。③MRJP-1是MRJPs的主要活性成分。由于MRJPs组细胞存活率与MRJP-1组均无显著差异,可以推测MRJP-1是MRJPs中促进细胞生长的关键因子。本论文所建立的用MRJP-1特异性抗体检测蜂王浆质量的新方法,MRJP-1和MRJPs可部分替代牛血清作为5种细胞生长因子的研究在国内外属于首次报道,具有创新意义。

关键词：王浆主蛋白王浆主蛋白1 特异性抗体分离测定细胞促生长

王浆主蛋白的分离提取及其对非酒精性脂肪肝预防效果研究

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王浆主蛋白的分离提取及其对非酒精性脂肪肝预防效果研究

作者：张晓晨华东理工大学

学位级别：硕士

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是世界上最常见的一种慢性肝病,其主要特征是脂质代谢障碍和氧化应激加剧,寻找能够预防NAFLD发生的天然产物成为现今辅助治疗NAFLD的重要发展趋势。本文以蜂王浆样品中的主要活性物质——王浆主蛋白（MRJPs）为... 详细信息

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是世界上最常见的一种慢性肝病,其主要特征是脂质代谢障碍和氧化应激加剧,寻找能够预防NAFLD发生的天然产物成为现今辅助治疗NAFLD的重要发展趋势。本文以蜂王浆样品中的主要活性物质——王浆主蛋白（MRJPs）为研究对象,优化其提取工艺,并在此基础上利用油酸（OA）构建体外肝细胞脂积累模型和HepG2细胞线粒体功能障碍模型,探究MRJPs预防NAFLD发生的作用机制,旨在为开发高附加值的肽类药物提供依据。主要研究成果如下:（1）采用离心透析法从蜂王浆中提取MRJPs,所得最佳工艺提取条件如下:提取液液料比8:1 mL/g、提取液pH值为7、提取时间4 h、透析时间24 h。在最佳工艺条件下,每2.5 g的蜂王浆中能提取得到0.314±0.051 g的MRJPs,平均得率为12.56%。（2）通过SDS-PAGE鉴定出 MRJPs中的主要成分为MRJP5（72kDa）、MRJP4（68kDa）、MRJP3（64kDa）、MRJP1（57kDa）和 MRJP2（49kDa）,且超高速离心法所得的结果进一步证实MRJP1是MRJPs的主要成分。（3）采取 1.00 mmol/L 的 OA 孵育 HepG2 细胞 24 h 或 0.50 mmol/L 的 OA 孵育 L02细胞24 h均能有效构建体外肝细胞脂积累模型,该模型细胞质内出现大量脂滴且脂滴积聚明显,细胞内甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）含量升高、超氧化物歧化酶（SOD）活力降低,培养基中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）含量升高,而提前使用0.2、0.5、1.0 g/L的MRJPs预孵育这两种细胞24 h所得结果同模型组相比,细胞质内脂滴积聚减少,细胞内TG和TC含量降低,SOD活力升高,培养基中ALT/AST含量降低。这说明MRJPs能预防脂代谢障碍和肝细胞氧化应激。（4）采取0.50 mmol/L的OA孵育HepG2细胞48 h能有效构建体外线粒体功能障碍模型,该模型细胞线粒体膜电位（MMP）降低,三磷酸腺苷（ATP）含量减少,而提前使用0.2、0.5、1.0 g/L的MRJPs预孵育HepG2细胞24h能维持HepG2细胞正常的MMP和ATP含量。这说明MRJPs能预防线粒体功能的完备性受损。（5）采用0.50 mmol/L的OA孵育HepG2细胞48 h能有效降低沉默调节蛋白3（SIRT3）、线粒体超氧化物歧化酶（SOD2）、细胞色素C氧化酶IV（COXIV）的mRNA及蛋白的表达量,且在一定程度上能够抑制单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶（AMPK）的磷酸化,而提前使用0.2、0.5、1.0g/L的MRJPs预孵育HepG2细胞24h能上调SIRT3、SOD2、COXIV的mRNA及蛋白的表达量,同时抑制SIRT3的表达将会阻碍MRJPs发挥预防作用。这说明MRJPs介导的SIRT3表达上调及其下游SOD2与COXIV的表达上调可能是MRJPs发挥其预防NAFLD的关键环节,而AMPK信号通路可能是MRJPs上调SIRT3表达的一条重要途径和分子基础。

关键词：王浆主蛋白细胞模型脂质积累线粒体功能障碍 AMPK/SIRT3信号通路

蜂王浆主蛋白(MRJPs)超滤分离工艺优化及产物质量分析

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2014年第5期40卷 526-532页

作者：李玫璐谭量量裘卫尹志红沈立荣浙江大学生物系统工程与食品科学学院馥莉食品科学研究院杭州310058 杭州碧于天保健品有限公司杭州311500

采用超滤方法从鲜王浆中提取王浆主蛋白(major royal jelly proteins,MRJPs),先就水料比、pH、离子强度3种单因素对MRJPs提取率的影响进行单因素分析,然后通过正交试验对MRJPs的超滤提取工艺进行优化,最后对MRJPs分离产物冻干粉和滤后... 详细信息

采用超滤方法从鲜王浆中提取王浆主蛋白(major royal jelly proteins,MRJPs),先就水料比、pH、离子强度3种单因素对MRJPs提取率的影响进行单因素分析,然后通过正交试验对MRJPs的超滤提取工艺进行优化,最后对MRJPs分离产物冻干粉和滤后液进行成分测定.结果表明:最佳提取工艺为水料体积质量比5:1(mL/g),pH 7.0,离子强度0.5 mol/L.在最佳工艺条件下,MRJPs的提取率为82.63%,冻干粉含可溶性蛋白91.00%、水分0.01%、总糖15.22%、王浆酸2.00%,超滤副产物——滤后液中王浆酸和总糖的回收率分别为3.60%和2.11%.超滤工艺具有无溶剂污染、王浆成分可回收利用,适合规模化生产的优点,为MRJPs分离提取提供了新的工艺方法,为王浆深加工和MRJPs蛋白产品开发提供了科学依据.

关键词：蜂王浆王浆主蛋白超滤分离正交试验

胃-胰蛋白酶水解蜂王浆主蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽工艺的优化

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2012年第4期38卷 511-518页

作者：张伟光袁鹏尹志红裘卫沈立荣浙江大学生物系统工程与食品科学学院浙江杭州310058 杭州碧于天保健品有限公司浙江杭州311500

采用胃-胰蛋白酶水解蜂王浆主蛋白(MRJPs),对底物浓度、pH值、酶作用时间和蛋白酶浓度对水解效果的影响进行单因素分析,然后通过正交试验对胃-胰蛋白酶共同作用的酶解工艺进行优化;最后采用超滤分离技术对王浆主蛋白水解产物(H-MRJPs)... 详细信息

采用胃-胰蛋白酶水解蜂王浆主蛋白(MRJPs),对底物浓度、pH值、酶作用时间和蛋白酶浓度对水解效果的影响进行单因素分析,然后通过正交试验对胃-胰蛋白酶共同作用的酶解工艺进行优化;最后采用超滤分离技术对王浆主蛋白水解产物(H-MRJPs)进行分离,以制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽。结果表明:优化的酶解工艺为37℃恒温、质量比为1%的胃蛋白酶(pH=2.0)和胰蛋白酶(pH=7.5)各水解2h;在最佳工艺条件下,MRJPs水解度为28.7%,总氮回收率为35.5%;通过SDS-PAGE电泳未检测到MRJPs水解产物(H-MRJPs)含有明显的蛋白条带;采用超滤法对H-MRJPs分离得到分子质量范围为5ku的3类血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,其ACE半抑制质量浓度(IC50)分别为0.33、0.61和***-1,即以分子质量王浆主蛋白开发降压功能食品提供了科学依据。

关键词：王浆主蛋白胃-胰蛋白酶酶解技术超滤血管紧张素转化酶抑制肽

西方蜜蜂不同级型王浆主蛋白MRJP8基因的表达差异

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昆虫学报 2014年第1期57卷 1-7页

作者：李江红梁庆环陈大福梁勤福建农林大学蜂学学院福州350002

【目的】王浆主蛋白在蜜蜂的级型分化中具有重要的功能。为探究mrjp8在西方蜜蜂Apis mellifera不同级型的表达模式及功能差异。【方法】利用荧光定量PCR技术对西方蜜蜂工蜂、雄蜂和蜂王不同发育时期和不同组织的mrjp8表达水平进行检测... 详细信息

【目的】王浆主蛋白在蜜蜂的级型分化中具有重要的功能。为探究mrjp8在西方蜜蜂Apis mellifera不同级型的表达模式及功能差异。【方法】利用荧光定量PCR技术对西方蜜蜂工蜂、雄蜂和蜂王不同发育时期和不同组织的mrjp8表达水平进行检测。【结果】工蜂体内mrjp8在9日龄前后的毒腺组织内特异性高表达,为参照基因表达量的上万倍,在其他发育时期和组织的表达量则明显较低,其表达具有明显的时空特异性;在雄蜂体内其表达量与对照相当;在蜂王体内表达量可达参照的近1 000倍,没有组织特异性。【结论】mrjp8的这种表达模式提示其在工蜂防御及维系蜂王长寿命方面有积极作用,这为进一步研究该基因乃至整个王浆蛋白基因家族的进化和功能分化提供了依据。

关键词：西方蜜蜂级型王浆主蛋白表达模式荧光定量PCR

RNAi沉默王浆主蛋白1(Mrjp1)基因对意大利蜜蜂工蜂学习和记忆的影响

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昆虫学报 2021年第10期64卷 1145-1152页

作者：蔚添添邱园妹候梦赏王天宝苏松坤李志国福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 福州350002

【目的】前期研究发现经吡虫啉处理的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称“意蜂”)工蜂学习能力下降,转录组学分析表明王浆主蛋白1(major royal jelly protein 1,MRJP1)基因在吡虫啉处理的蜜蜂脑中显著下调,MRJP1可能参与调控蜜... 详细信息

【目的】前期研究发现经吡虫啉处理的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称“意蜂”)工蜂学习能力下降,转录组学分析表明王浆主蛋白1(major royal jelly protein 1,MRJP1)基因在吡虫啉处理的蜜蜂脑中显著下调,MRJP1可能参与调控蜜蜂学习能力。本研究旨在采用RNA干扰(RNA inference,RNAi)技术将Mrjp1特异性沉默,验证MRJP1在意蜂工蜂嗅觉学习中的关键作用。【方法】通过克隆技术获得Mrjp1基因cDNA序列,经测序验证后,设计引物,合成用于RNAi干扰Mrjp1基因表达的dsRNA。注射dsMrjp1的意蜂工蜂作为处理组(dsMrjp1注射组),注射dsEGFP的意蜂工蜂作为对照组(dsEGFP注射组),随后通过伸吻反应(proboscis extension response,PER)实验比较两组的嗅觉学习与记忆能力差异。最后采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测注射dsMrjp1后意大利蜜蜂工蜂脑中Mrjp1的相对表达量。【结果】dsMrjp1注射组与dsEGFP注射组意蜂工蜂学习能力差异显著,dsMrjp1注射组意蜂工蜂的学习能力显著降低。学习后2 h,两组意蜂工蜂的记忆力无显著差异。qRT-PCR结果显示Mrjp1的表达水平在dsMrjp1注射组意蜂工蜂脑中显著低于dsEGFP注射组,表明学习能力降低的处理组意蜂脑内对应的Mrjp1表达水平也降低。【结论】通过RNAi抑制意蜂工蜂Mrjp1基因的表达后,其嗅觉学习能力受到显著性抑制,但记忆力未受到显著影响,提示Mrjp1可能是调控意蜂学习的重要基因之一。本研究结果有助于后续进一步研究蜜蜂嗅觉学习相关的分子机制。

关键词：意大利蜜蜂王浆主蛋白 RNA干扰嗅觉学习记忆伸吻反应

不同储存温度对王浆主蛋白及其生理活性的影响

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中国老年学杂志 2011年第5期31卷 841-842页

作者：王婷杨旭郑州大学第二附属医院检验科河南郑州450014 中国农业大学食品科学与营养工程学院

目的分析不同储存条件下王浆蛋白质组分的变化。方法将不同储存条件下的王浆蛋白样品进行双向电泳。结果在室温下储存30 d,室温、4℃、-20℃条件下储存80 d的王浆样品共检测到蛋白点数分别为63、69、45和75个。王浆主蛋白(Apalbumin)1在... 详细信息

目的分析不同储存条件下王浆蛋白质组分的变化。方法将不同储存条件下的王浆蛋白样品进行双向电泳。结果在室温下储存30 d,室温、4℃、-20℃条件下储存80 d的王浆样品共检测到蛋白点数分别为63、69、45和75个。王浆主蛋白(Apalbumin)1在4种储存条件下均为过饱和点;Apalbumin 2和Apalbumin 3的蛋白含量并未随着储存温度的升高和时间的延长而明显减少;Apalbumin 4和葡萄糖氧化酶的蛋白点只出现在-20℃条件下;Apalbumin 5只出现于4℃和-20℃条件下。结论储存温度对Apalbumin 1、Apalbumin 2和Apalbumin 3的影响不大,而Apalbumin 4、Apalbumin 5和葡萄糖氧化酶对储存温度敏感,在常温下易发生降解,其生物活性易受到破坏。

关键词：王浆主蛋白储存温度双向电泳

蜜蜂王浆主蛋白(MRJPs)基因家族结构与功能概述

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环境昆虫学报 2013年第4期35卷 494-501页

作者：梁庆环李江红梁勤陈大福福建农林大学蜂学学院福州350002

王浆主蛋白(Major royal jelly proteins,MRJPs)是王浆中的水溶性蛋白,为王浆蛋白的主要组分。因结构与功能的相似性,各王浆蛋白编码基因构成一个基因家族。目前该基因家族已鉴定出9个成员,依次命名为mrjp1～9。该家族为单系群,拥有共... 详细信息

王浆主蛋白(Major royal jelly proteins,MRJPs)是王浆中的水溶性蛋白,为王浆蛋白的主要组分。因结构与功能的相似性,各王浆蛋白编码基因构成一个基因家族。目前该基因家族已鉴定出9个成员,依次命名为mrjp1～9。该家族为单系群,拥有共同的祖先—yellow-e3,各成员之间具有较高的同源性。随着进化的进行,该家族逐步进化出营养及其它多种生物学功能。本文从该基因家族成员的鉴定、基因和蛋白质的结构特征、进化、功能以及其表达调控等多个方面进行综述,以期为相关的研究和应用提供帮助。

关键词：蜜蜂王浆主蛋白基因家族结构功能