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猪肠病毒g型实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

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中国兽医科学 2020年第5期50卷 563-569页

作者：杨春杰米雪刘雪婷蹇慧刘芳陈樱韦祖樟黄伟坚欧阳康广西大学动物科学技术学院广西南宁530005

为建立一种能够准确、快速地鉴别猪肠病毒g型的诊断方法,本研究参考猪肠病毒g型的3D基因序列设计1对特异性引物,扩增片段预计大小约为104 bp,将3D基因片段克隆到pMD18-T载体上的阳性重组质粒作为标准品,建立猪肠病毒g型的实时定量PCR检... 详细信息

为建立一种能够准确、快速地鉴别猪肠病毒g型的诊断方法,本研究参考猪肠病毒g型的3D基因序列设计1对特异性引物,扩增片段预计大小约为104 bp,将3D基因片段克隆到pMD18-T载体上的阳性重组质粒作为标准品,建立猪肠病毒g型的实时定量PCR检测方法,并应用到临床样品的检测。研究结果显示,该方法设计的引物具有高度的特异性;标准曲线的Cq值与质粒标准品模板在2.92×10^8copies/μL^2.92×10^2copies/μL范围内,呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-4.023;组内与组间重复性试验显示变异系数很小,在0.26%~1.57%之间。该方法的最低检测限量可达2.92×10 copies/μL。使用本方法对2017-2019年广西部分地区的猪场临床腹泻粪便样品进行检测,猪肠病毒g型阳性检出率为18.42%,说明广西部分地区的猪场存在猪肠病毒g型的感染。本研究成功建立了猪肠病毒g型实时定量PCR检测方法,可用于猪肠病毒g型感染的临床检测。

关键词：猪肠病毒g型实时定量PCR 检测方法

猪肠病毒g型部分VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

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中国动物传染病学报 2024年第3期32卷 178-182页

作者：边金妮黄诗婷许佳乐米雪王奕斐杜琛陈樱韦祖樟黄伟坚欧阳康广西大学动物科学技术学院动物传染病与分子免疫学实验室南宁530005

本研究扩增猪肠病毒g型(EV-g)的部分VP1基因,将其克隆至原核表达载体,并对其进行诱导表达,获得重组蛋白并制备多克隆抗体,通过酶联免疫吸附试验,免疫印迹试验和间接免疫荧光试验对其进行验证。结果表明,本研究制备的兔抗EV-g-VP1多克隆... 详细信息

本研究扩增猪肠病毒g型(EV-g)的部分VP1基因,将其克隆至原核表达载体,并对其进行诱导表达,获得重组蛋白并制备多克隆抗体,通过酶联免疫吸附试验,免疫印迹试验和间接免疫荧光试验对其进行验证。结果表明,本研究制备的兔抗EV-g-VP1多克隆抗体具有良好的免疫原性和反应性,可以特异性识别EV-g感染Marc-145细胞表达的VP1蛋白,为猪肠病毒g型免疫学检测方法的建立提供良好的生物学材料。

关键词：猪肠病毒g型部分VP1蛋白原核表达多克隆抗体

猪肠病毒g型四川株CHN-SCMY2021的分离鉴定与四川地区流行病学调查

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猪肠病毒G型四川株CHN-SCMY2021的分离鉴定与四川地区流行病学调查

作者：肖黛四川农业大学

学位级别：硕士

猪肠病毒g型(Porcine enterovirus g,EV-g)是小RNA病毒科肠道病毒属成员,主要可引起猪脑脊髓灰质炎、腹泻、发热、神经疾病等,也存在无症状感染。各年龄段猪均可感染EV-g,但断奶仔猪最为敏感。目前为止,在多个国家均有关于EV-g的报道,... 详细信息

猪肠病毒g型(Porcine enterovirus g,EV-g)是小RNA病毒科肠道病毒属成员,主要可引起猪脑脊髓灰质炎、腹泻、发热、神经疾病等,也存在无症状感染。各年龄段猪均可感染EV-g,但断奶仔猪最为敏感。目前为止,在多个国家均有关于EV-g的报道,但我国四川省尚未见相关研究报道。为了掌握四川地区EV-g的相关情况,本研究开展了病原分离鉴定及流行病学调查,主要内容如下:1.猪肠病毒g型四川株CHN-SCMY2021的分离鉴定利用ST细胞从四川绵阳某猪场后备母猪腹泻的粪便样品中分离到一株EV-g,根据样品来源时间和地点将其命名为CHN-SCMY2021,并对该分离株进行生物特性研究和系统发育分析。结果如下:三轮噬斑试验纯化后,在透射电镜下可观察到直径约25 nm的病毒粒子。表达病毒的VP1蛋白,制备兔抗EV-g-VP1蛋白多克隆抗体,通过间接免疫荧光试验,发现该毒株能感染LLC-PK、PK-15、IPEC-J2、BHK-21和Vero细胞,具有多细胞适应特征。分离株在56°C条件下处理1 h仍具有感染性,在60°C条件下作用1 h可被完全灭活,对氯仿不敏感,紫外照射30 min能使病毒滴度降低,但不能够完全灭活病毒,2‰的甲醛可以使病毒完全灭活。病毒全基因测序结果显示EV-g CHN-SCMY2021基因组全长为7341 nt(gen Bank登录号MZ747373)。VP1基因进化树分析表明该毒株属于g2基因型,且与日本分支进化距离相对较近。分离株的重组分析表明,CHN-SCMY2021是由亲本714171/Cao Lanh＿VN(gen Bank登录号:KT265894.2)和次亲本LP54(gen Bank登录号:AF363455.1)重组而成。2.四川株CHN-SCMY2021的仔猪致病性研究为深入探究该毒株对仔猪的致病性,本试验使用第21代分离毒经口服感染6日龄仔猪进行致病性研究。结果表明,部分攻毒组仔猪在病毒感染20 h后出现轻微腹泻症状,而对照组无异常。攻毒5 d后将仔猪安乐死,剖检可见攻毒组仔猪肠壁变薄鼓气。荧光定量PCR结果显示,攻毒组仔猪多个器官均能够检测出病毒核酸。病理切片结果显示攻毒组十二指肠部分肠绒毛顶部上皮细胞坏死脱落,细胞核固缩、深染、碎裂或溶解消失,毛细血管充血,除结肠无明显病理改变外,其余肠段均有少量淋巴细胞浸润;肺组织局部坏死伴出血,结构消失,坏死灶周围肺泡腔内可见大量巨噬细胞浸润,对照组无异常。3.四川地区猪肠病毒g型的流行病学调查针对EV-g参考序列的5’UTR保守区域设计一对特异性检测引物,建立一种EV-g的荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行灵敏性、特异性和重复性的检验,结果如下:建立的荧光定量PCR方法可检测的下限为1.89×10 copies/μL,比普通PCR灵敏10倍;在该方法的特异性检测中,PDCo V、PEDV、TgEV、JEV、PSV、PCV、PPV、PRV、PRRSV均未出现阳性扩增,表明特异性强;在重复性实验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重复性好。运用所建立的荧光定量PCR方法对四川地区2013～2021年共431份腹泻病料进行检测,其中EV-g阳性率为31.1%,挑选9份阳性样品扩增VP1片段构建系统发育树,结果显示四川地区EV-g呈多基因型共存的现状。综上,本研究分离到一株EV-g2,并对其生物学特性、系统发育分析以及致病性进行研究,构建了检测EV-g的荧光定量PCR方法,并初步掌握四川地区该病毒的流行情况,为后续开展EV-g的研究奠定了基础。

关键词：猪肠病毒g型分离鉴定仔猪致病性荧光定量PCR 流行病学

凸隆病毒PLpro基因自然重组于猪肠病毒g型的发现

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中国兽医科学 2022年第11期52卷 1430-1436页

作者：黄诗婷洪大林秦秋英许佳乐边金妮陈樱韦祖樟黄伟坚欧阳康广西大学动物科学技术学院动物传染病与分子免疫学实验室广西南宁530005

为调查广西地区猪肠病毒g型(EV-g)基因组中是否存在PLpro基因的自然插入,并获得序列信息,本研究对2019—2021年广西区内347份临床腹泻样品进行EV-g PLpro基因的监测,发现32份EV-g阳性,其中4份EV-g阳性样品含有PLpro基因。扩增PLpro基因... 详细信息

为调查广西地区猪肠病毒g型(EV-g)基因组中是否存在PLpro基因的自然插入,并获得序列信息,本研究对2019—2021年广西区内347份临床腹泻样品进行EV-g PLpro基因的监测,发现32份EV-g阳性,其中4份EV-g阳性样品含有PLpro基因。扩增PLpro基因及VP1基因序列分析结果显示,4株PLpro序列与EV-g PLpro参考序列中均存在具有去泛素化酶活性的催化三联体残基,且蛋白两端都有3C蛋白酶水解位点,负责将外源蛋白水解至基因组外完成翻译。VP1基因序列分析结果显示,4株分别为EV-g1、EV-g10和EV-g14基因型。本研究首次在我国发现EV-g10及EV-g14基因型毒株的基因组中存在PLpro基因的插入,该结果为初步明确广西区内EV-g-PLpro毒株的流行概况及其遗传演化特点提供了数据支持。

关键词：猪肠病毒g型 PLpro蛋白酶自然重组基因分析