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适应肠道细胞的猪德尔塔冠状病毒对仔猪的致病性分析

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中国农业大学学报 2024年第5期29卷 56-64页

作者：石迎陶洁李本强程靖华刘惠莉上海市农业科学院畜牧兽医研究所/上海市农业遗传育种重点实验室上海201106 上海市种猪工程技术中心上海201302

为分析适应肠道细胞的猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)对仔猪的致病性,本研究首先用ST细胞分离培养的PDCoV感染IPEC-J2细胞进行适应性试验,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测PDCoV抗原,然后绘制病毒生长曲线,最后分析适... 详细信息

为分析适应肠道细胞的猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)对仔猪的致病性,本研究首先用ST细胞分离培养的PDCoV感染IPEC-J2细胞进行适应性试验,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测PDCoV抗原,然后绘制病毒生长曲线,最后分析适应IPEC-J2细胞的PDCoV对仔猪的致病性。结果表明:1)经ST细胞分离培养的PDCoV可以感染IPEC-J2细胞并出现CPE,可在细胞内检测到PDCoV抗原,PDCoV在感染IPEC-J2细胞后48 h达到增殖高峰。2)适应IPEC-J2的PDCoV对仔猪具有肠致病性,仔猪出现明显腹泻症状,甚至出现死亡;剖检可见明显的肠道病变,病理组织学显示肠上皮细胞及肠绒毛病变,并通过免疫组化对抗原进行定位,发现PDCoV广泛分布于肠道上皮细胞。3)肠道免疫细胞因子分析发现PDCoV感染仔猪后肠道I型干扰素表达上调,同时激活体内Th1和Th2型肠道细胞免疫反应,诱导感染仔猪产生免疫细胞因子发挥抗病毒作用。综上,经ST细胞分离培养的PDCoV对IPEC-J2细胞具有较强的适应性,并对仔猪产生较强的致病性。本研究为PDCoV致病机制及抗病毒免疫进一步研究奠定基础。

关键词：猪德尔塔冠状病毒 IPEC-J2细胞仔猪免疫反应致病机理

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猪德尔塔冠状病毒病的诊断与防治

今日畜牧兽医 2024年第3期40卷 104-106页

作者：朱家春沛县魏庙镇综合服务中心 221639

猪德尔塔冠状病毒属于较为严重的猪类传染病,可感染不同生长阶段的猪群,其中以5~15日龄哺乳仔猪最易感,主要症状包括高热、咳嗽、打喷嚏、流涕、呼吸困难、腹泻等,且哺乳仔猪感染后死亡率高达30%~40%,而成年猪、生长猪及生产母猪症状表... 详细信息

猪德尔塔冠状病毒属于较为严重的猪类传染病,可感染不同生长阶段的猪群,其中以5~15日龄哺乳仔猪最易感,主要症状包括高热、咳嗽、打喷嚏、流涕、呼吸困难、腹泻等,且哺乳仔猪感染后死亡率高达30%~40%,而成年猪、生长猪及生产母猪症状表现轻微,一般可不治而愈,猪德尔塔冠状病毒的出现给世界养猪业造成了巨大的经济损失。研究显示,猪德尔塔冠状病毒与α-冠状病毒具有相似的临床症状和病理变化,感染后可引起猪只的水样腹泻、脱水和死亡。据此,本文结合猪德尔塔冠状病毒病诊断进行探讨,并结合实际提出相应的防治措施,旨在为生猪养殖产业安全发展提供参考。

关键词：猪德尔塔冠状病毒流行特点防治措施

稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的Vero细胞系的建立及鉴定

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中国动物传染病学报 2024年第1期32卷 56-61页

作者：钱炳旭薄宗义白雪雁张成成郭梦娇李梦娇廖凯薛峰吴艳涛张小荣扬州大学兽医学院江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225000 南京农业大学动物健康与食品安全国际合作实验室南京210095 扬州大学农业科技发展研究院教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室扬州225000

为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)核衣壳(N)蛋白的非洲绿猴肾(Vero)细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,... 详细信息

为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)核衣壳(N)蛋白的非洲绿猴肾(Vero)细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,嘌呤霉素加压筛选目的细胞。RT-PCR扩增N基因和测序表明细胞系基因组中存在N蛋白编码序列,Western blot和IFA试验表明N蛋白可在细胞系中稳定表达。应用制备的细胞系对临床PDCoV阳性血清样品进行检测,与ELISA检测结果符合率达到100%。本研究成功建立了稳定表达PDCoV N蛋白的Vero细胞系,为PDCoV N蛋白生物学特性研究和PDCoV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。

关键词：猪德尔塔冠状病毒核衣壳(N)蛋白慢病毒稳转细胞系

基于重组核衣壳蛋白的猪德尔塔冠状病毒间接ELISA检测方法的建立

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安徽科技学院学报 2024年第3期38卷 25-33页

作者：胡帅琪丛潇练月晓伍妙梨朱于军丛锋顾有方闻爱友安徽科技学院动物科学学院安徽凤阳233100 动物营养调控与健康安徽省重点实验室安徽凤阳233100 广东省实验动物监测所广东省实验动物重点研究室广东广州510633

目的:建立一种关于猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus, PDCoV)抗体的检测方法。方法:对猪德尔塔冠状病毒的核衣壳蛋白(N)进行原核表达,通过Western Blot、SDS-PAGE等方法,对重组蛋白进行鉴定;在获得正确表达的重组蛋白后,以此... 详细信息

目的:建立一种关于猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus, PDCoV)抗体的检测方法。方法:对猪德尔塔冠状病毒的核衣壳蛋白(N)进行原核表达,通过Western Blot、SDS-PAGE等方法,对重组蛋白进行鉴定;在获得正确表达的重组蛋白后,以此为抗原,对ELISA反应条件进行优化,并对其特异性、敏感性、重复性进行测试,最终建立ELISA检测方法,并对临床样品进行检测。结果:优化后的抗原包被浓度为2μg/孔,37℃孵育1 h;1%BSA 37℃封闭1 h;一抗稀释最佳浓度为1∶1 600,孵育时间为1 h;酶标二抗最佳孵育时间为60 min。重组蛋白能与猪德尔塔冠状病毒血清发生特异性反应,所建立的检测方法具有优良的敏感性、特异性、重复性。结论:本研究建立了一种针对猪德尔塔冠状病毒的间接ELISA检测方法,为猪德尔塔冠状病毒的抗体水平检测及疾病的防控提供了一种有效的方法。

关键词：猪德尔塔冠状病毒重组核衣壳蛋白间接ELISA 诊断方法

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猪德尔塔冠状病毒昆明小鼠感染模型的建立

中国动物传染病学报 2023年

作者：宋俊菡王元红邓小莺王俊娜虞凌雪王斌周艳君童光志李国新中国农业科学院上海兽医研究所默沙东(宁波)动物保健科技有限公司

为了建立猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染昆明小鼠模型，本研究用PDCoV(JS2211株)对8周龄SPF级雌性昆明小鼠进行了感染试验。感染组接种病毒原液(107.6TCID50/mL)，灌胃200uL，肌肉注射100uL；对照组经相同方式接种等体积的生理盐水。每日... 详细信息

为了建立猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染昆明小鼠模型，本研究用PDCoV(JS2211株)对8周龄SPF级雌性昆明小鼠进行了感染试验。感染组接种病毒原液(107.6TCID50/mL)，灌胃200uL，肌肉注射100uL；对照组经相同方式接种等体积的生理盐水。每日观察小鼠临床症状，并在感染后的第1、3、5、7、10、14、21d，随机选取3只感染组小鼠及1只对照组小鼠，采集脏器进行组织病理学观察，并通过qRT-PCR测定不同脏器病毒分布情况。结果显示，感染组小鼠在第7d、14d和21d出现肠道充气、水肿，肠壁变薄，肠道及肠系膜出血；组织病理学观察显示，感染14d小鼠肠绒毛部分缺损脱落，绒毛密度低、变短、肠壁变薄，肠系膜有明显出血现象，胃黏膜上皮细胞浅表伴有少许糜烂、脱落，并可见大量炎性细胞浸润；qRT-PCR检测发现PDCoV主要入侵小鼠肠道组织，且在感染14d时，病毒水平达到峰值。本研究为抗PDCoV生物制品及药物的有效性评价建立了良好的动物模型。

关键词：猪德尔塔冠状病毒昆明小鼠动物模型

猪德尔塔冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2017年第9期47卷 1080-1086页

作者：肖帅刘新生方玉珍周鹏张巧玲芦延珍董昭良张永光王永录魏彦明甘肃农业大学生命科学技术学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

根据GenBank中已公布的猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)N基因序列设计并合成特异的引物和TaqMan探针,构建质粒标准品,以标准品为模板建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了评价。结果显示,以... 详细信息

根据GenBank中已公布的猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)N基因序列设计并合成特异的引物和TaqMan探针,构建质粒标准品,以标准品为模板建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了评价。结果显示,以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪库布病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和口蹄疫病毒为模板时均未检测到荧光信号,表明该方法具有良好的特异性;用2.66×10~6、2.66×10~5和2.66×10~4copies/L这3个不同浓度的质粒标准品进重复试验,循环阈值Ct的变异系数均低于2%,表明该方法具有良好的特异性;标准曲线斜率为-3.461,相关系数为R^2=0.998,表明阈值和模板浓度之间具有良好的线性关系。10倍梯度稀释质粒标准品,检测的最低限度为2.66×10~1 copies/L的质粒DNA,表明此方法具有良好的敏感性。利用该方法对194份临床猪粪便样品进行了检测,结果显示PDCoV阳性率为22.1%,明显高于常规RT-PCR的11.9%,表明该方法可应用于PDCoV的临床诊断及定量检测。

关键词：猪德尔塔冠状病毒实时荧光定量PCR 病毒检测

猪德尔塔冠状病毒重组聚合酶扩增检测方法的建立与应用

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动物医学进展 2019年第3期40卷 9-14页

作者：肖帅刘新生方玉珍周鹏张永光王永录魏彦明甘肃农业大学生命科学技术学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

为了快速检测猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),针对PDCoV N基因设计特异的引物,建立了猪德尔塔冠状病毒重组聚合酶扩增(RPA)方法。特异性试验中以PPRSV、PEDV、PKV、TGEV和FMDV为模板时均未产生任何条带,特异性较好。该检测方法的灵敏度为103 c... 详细信息

为了快速检测猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),针对PDCoV N基因设计特异的引物,建立了猪德尔塔冠状病毒重组聚合酶扩增(RPA)方法。特异性试验中以PPRSV、PEDV、PKV、TGEV和FMDV为模板时均未产生任何条带,特异性较好。该检测方法的灵敏度为103 copies/μL,敏感性较好。用该方法检测194份仔猪腹泻样品,PDCoV阳性率为14.4%,较常规RT-PCR阳性率为11.9%更高。研究所建立的猪德尔塔冠状病毒RPA检测方法具有反应快速、操作简单、结果可靠、设备要求低等优点,可为基层简易实验室提供一种方便适用的快速检测方法。

关键词：猪德尔塔冠状病毒重组聚合酶扩增快速检测

猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2022年第3期52卷 298-303页

作者：张景连李本强陶洁石迎程靖华乔长涛刘惠莉上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海201106 上海师范大学上海200234

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)作为一种新型的猪肠道腹泻病毒,建立快速有效的检测手段十分必要。本研究根据PDCoV N基因中的保守序列设计了1对特异性引物,PCR扩增后克隆至pEASY-Blunt Zero载体,构建了阳性质粒pEASY-PDCoV/N。以阳性质粒pEASY... 详细信息

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)作为一种新型的猪肠道腹泻病毒,建立快速有效的检测手段十分必要。本研究根据PDCoV N基因中的保守序列设计了1对特异性引物,PCR扩增后克隆至pEASY-Blunt Zero载体,构建了阳性质粒pEASY-PDCoV/N。以阳性质粒pEASY-PDCoV/N为模板,建立了检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,并对其敏感性、特异性和重复性等进行了优化与验证。结果显示,C_(1)值与标准模板在5.83×10^(7)~5.83×10^(1)copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.999,线性方程的斜率为-3.323,最低检测限度为5.83×10^(1)copies/μL。该方法特异性和重复性均较好,对PEDV、PRV、TGEV等病毒均未出现检测信号,批内和批间变异系数分别小于1%和2%。利用建立的PDCoV荧光定量PCR检测方法对60份猪腹泻样品进行核酸检测,阳性率为18.3%,比普通PCR检出率高6.7%。结果表明,该方法可适用于临床快速检测PDCoV,为该病的预防和控制提供技术支持。

关键词：猪德尔塔冠状病毒 N基因荧光定量PCR

猪德尔塔冠状病毒N蛋白原核表达及多克隆抗体制备

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中国动物传染病学报 2022年

作者：叶晨倩李智丽叶曼青秦文珍杨心雨翟雪滢郑浩童武李国新于海童光志单同领娄华孔宁佛山科学技术学院中国农业科学院上海兽医研究所

猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）是一种新发的病原体，引起仔猪腹泻、脱水和呕吐等症状。本研究以PDCoV的RNA为模版，扩增PDCoV N基因，将其插入原核表达载体pCold I中，构建PDCoV N-pCold I质粒；通过BL21（DE3）原核表达和纯化获得高纯度的... 详细信息

猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）是一种新发的病原体，引起仔猪腹泻、脱水和呕吐等症状。本研究以PDCoV的RNA为模版，扩增PDCoV N基因，将其插入原核表达载体pCold I中，构建PDCoV N-pCold I质粒；通过BL21（DE3）原核表达和纯化获得高纯度的PDCoV N蛋白；免疫BALB/c小鼠，制备PDCoV N蛋白多克隆抗体。结果显示，原核表达的PDCoV N蛋白为可溶性蛋白，分子量约为40 kDa；通过ELISA、Western blot和IFA鉴定，本研究制备的PDCoV N多克隆抗体均具有良好的效价，为深入开展PDCoV相关的基础和应用研究提供工具。

关键词：猪德尔塔冠状病毒 N蛋白原核表达多克隆抗体