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海藻糖酶基因TRE2-like和TRE2在异色瓢虫羽化过程中的表达与功能

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昆虫学报 2019年第6期62卷 663-671页

作者：张道伟李燕张萌王莎莎肖仲久曾伯平倪晓丽唐斌遵义师范学院生物与农业科技学院贵州遵义563006 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州310036

【目的】异色瓢虫Harmonia axyridis是一种重要的捕食性天敌昆虫,海藻糖在异色瓢虫的变态发育、羽化等整个生命过程都起着重要的作用。本研究以前期获得的类似膜结合型海藻糖酶(TRE2-like)与膜结合型海藻糖酶(TRE2)基因为基础,探讨在异... 详细信息

【目的】异色瓢虫Harmonia axyridis是一种重要的捕食性天敌昆虫,海藻糖在异色瓢虫的变态发育、羽化等整个生命过程都起着重要的作用。本研究以前期获得的类似膜结合型海藻糖酶(TRE2-like)与膜结合型海藻糖酶(TRE2)基因为基础,探讨在异色瓢虫羽化阶段这两个海藻糖酶的潜在功能,为阐明异色瓢虫从蛹发育到成虫时海藻糖代谢机制提供参考。【方法】根据TRE2-like和TRE2基因序列设计双链RNA(dsRNA)区域片段并合成对应的dsRNA,通过RNAi将其注射到异色瓢虫2日龄蛹中。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测RNAi处理后羽化第1天的异色瓢虫成虫糖代谢相关基因的表达;同时采用蒽酮比色法、酶标法等分别测定RNAi处理后羽化第1天的异色瓢虫成虫主要糖类物质含量及TRE活性变化,并观察异色瓢虫羽化后的表型变化。【结果】结果表明,与对照组(dsGFP注射组)相比,异色瓢虫2日龄蛹被注射TRE2-like或TRE2 dsRNA后,其新羽化成虫体内TRE2-like和TRE2表达量均极显著下调,且少数个体出现了蜕皮与翅形成困难等畸形表型。可溶性海藻糖酶活性在注射dsTRE2-like后显著降低,膜结合型海藻糖酶活性在注射dsTRE2后显著降低;注射dsTRE2后糖原含量显著下降,注射dsTRE2-like后糖原和海藻糖含量显著下降,注射dsTRE2-like+dsTRE2后糖原和葡萄糖含量显著下降,且海藻糖含量极显著下降。注射dsTRE2-like, dsTRE2和dsTRE2-like+dsTRE2后可溶性海藻糖酶基因TRE1-1和TRE1-2表达下降或显著下降,而TRE1-5表达上升或显著上升,海藻糖合成酶(trealose-6-phosphate synthase, TPS)、糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase, GP)、糖原合成酶(glycogen synthase, GS)基因的表达均显著下调。【结论】TRE2-like和TRE2基因表达被抑制后,异色瓢虫海藻糖等代谢受到影响。研究结果为探究异色瓢虫体内膜结合型海藻糖酶的潜在功能和调控机制奠定了基础。

关键词：异色瓢虫海藻糖酶 TRE2-like TRE2 基因表达酶活性 RNA干扰

褐飞虱海藻糖酶基因在表皮几丁质代谢中的调控作用

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中国农业科学 2017年第6期50卷 1047-1056页

作者：张露朱世城郑好沈祺达王世贵唐斌杭州师范大学生命与环境科学学院

【目的】昆虫海藻糖酶能够调控几丁质代谢并控制蜕皮过程。本研究通过TRE表达被抑制后,检测褐飞虱(Nilaparvata lugens)蜕皮状况、几丁质含量及几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)和几丁质酶(chitinase,Cht)基因表达情况,探究不同的海... 详细信息

【目的】昆虫海藻糖酶能够调控几丁质代谢并控制蜕皮过程。本研究通过TRE表达被抑制后,检测褐飞虱(Nilaparvata lugens)蜕皮状况、几丁质含量及几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)和几丁质酶(chitinase,Cht)基因表达情况,探究不同的海藻糖酶(trehalase,TRE)在褐飞虱表皮中对几丁质代谢的调控作用。【方法】采用RNAi技术,以实验室饲养种群褐飞虱为材料,通过向其体内注射双链RNA(dsRNA)分别抑制单个海藻糖酶基因或同时抑制多个海藻糖酶基因,注射48 h后通过Trizol法提取褐飞虱总RNA,反转录试剂盒合成第一链DNA后采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测该基因的表达情况,确定RNAi效果。氢氧化钾法测定48 h褐飞虱整体几丁质含量变化并对蜕皮困难虫体进行拍照;最后采用qRT-PCR检测褐飞虱CHS和Cht在mRNA水平上的相对表达量变化,分析TRE在调控几丁质代谢中的作用。【结果】与注射dsGFP相比较,其余各注射组褐飞虱整体几丁质含量显著下降,其中dsTRE1混合注射组与Validamycin注射组呈极显著下降,同时褐飞虱出现蜕皮困难等现象。qRT-PCR检测结果显示单个TRE的dsRNA注射后该基因的表达被抑制,但是部分TRE的表达有互补性上升。其中TRE1-2和TRE2在各注射组处理下表达均下降,dsTRE1s对TRE2的表达也有抑制效果,整体上dsTRE1混合注射组和海藻糖酶抑制剂Validamycin抑制效果明显;dsTRE注射组抑制CHS表达效果不明显,Validamycin能够显著降低CHS1和CHS1a在表皮中的表达,且2种dsTRE1注射后CHS1表达在上升,dsTRE1-2注射后表皮中的CHS1a的表达上升;Cht1和Cht8在dsTRE各注射组及Validamycin处理中表达下降或显著下降,dsTRE1-1注射后Cht2和Cht5表达显著上升;dsTRE1-2注射后Cht1、Cht6和Cht8表达下降,Cht2和Cht4表达显著上升;dsTRE2处理组中Cht1、Cht8和Cht10表达下降而Cht9表达显著上升;dsTRE1s注射后,Cht1和Cht5表达显著下降,而Cht9表达显著上升;Validamycin注射组中10个几丁质酶基因表达都显著或者极显著下降。【结论】TRE能够通过调控褐飞虱几丁质代谢途径来控制几丁质的合成,结果可为开展和筛选有效的海藻糖酶抑制剂控制褐飞虱等害虫提供理论依据。

关键词：褐飞虱 RNAi 海藻糖酶表皮几丁质代谢实时荧光定量PCR

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低温对淡色库蚊海藻糖和海藻糖酶的影响

中国血吸虫病防治杂志 2019年第5期31卷 510-512页

作者：张本光李亚平马荣程鹏郭秀霞王海防刘丽娟山东省寄生虫病防治研究所、山东第一医科大学(山东省医学科学院) 济宁272033 山东省金乡县农业局山东省济宁市第一人民医院

目的了解低温环境对淡色库蚊体内海藻糖和海藻糖酶含量的影响。方法在4℃环境中对淡色库蚊四龄初幼虫和雌成蚊分别冷处理0、1、3、6、12、18、24 h和0、1、3、6、12、18、24、36、48、72 h,采用酶联免疫吸附法测定低温处理不同时间淡色... 详细信息

目的了解低温环境对淡色库蚊体内海藻糖和海藻糖酶含量的影响。方法在4℃环境中对淡色库蚊四龄初幼虫和雌成蚊分别冷处理0、1、3、6、12、18、24 h和0、1、3、6、12、18、24、36、48、72 h,采用酶联免疫吸附法测定低温处理不同时间淡色库蚊幼虫和成蚊体内海藻糖和海藻糖酶含量。结果经低温处理后,淡色库蚊幼虫和雌成蚊体内海藻糖和海藻糖酶平均含量均明显增加。幼虫和雌成蚊体内海藻糖变化趋势一致,均在低温处理3 h达到最大值,平均值分别为(2.4588±0.3792)mg/g和(2.8257±0.2111)mg/g。海藻糖和海藻糖酶在低温处理前6 h内变化幅度较大,经过一段时间适应后,稳定保持在相对较高水平。结论低温能快速诱导淡色库蚊体内海藻糖和海藻糖酶产生,海藻糖和海藻糖酶在提高淡色库蚊抗寒性方面可能发挥重要作用。

关键词：淡色库蚊海藻糖海藻糖酶低温

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海藻糖酶结构及其抑制剂的农用活性研究进展

农药学学报 2022年第5期24卷 1017-1033页

作者：师东梅蒋志洋邹雪君黄家兴段红霞中国农业大学理学院应用化学系农药创新研究中心北京100193

海藻糖是一种非还原性二糖,在昆虫、真菌等有害生物体内参与能量代谢、逆境恢复、几丁质合成等过程。海藻糖酶(EC 3.***.1.28)由于其对海藻糖代谢及其含量调控具有重要作用,且在农业有害生物和哺乳动物体内存在功能差异,已成为开发新型农... 详细信息

海藻糖是一种非还原性二糖,在昆虫、真菌等有害生物体内参与能量代谢、逆境恢复、几丁质合成等过程。海藻糖酶(EC 3.***.1.28)由于其对海藻糖代谢及其含量调控具有重要作用,且在农业有害生物和哺乳动物体内存在功能差异,已成为开发新型农用化学品的安全型候选靶标。本文对海藻糖酶的晶体结构、海藻糖酶与底物/抑制剂的互作机制研究进展进行了综述;同时对具有农用活性的海藻糖酶抑制剂,如井冈霉素、天然产物salbostatin和trehazolin及其合成类似物、脱氧野尻霉素及其合成类似物、天然生物碱及其合成类似物以及胡椒碱及其类似物的研究进展进行了概述,并重点论述了以胡椒碱为骨架的化合物在农业有害生物防治上的应用。本综述可为靶向海藻糖酶结构进行新型胡椒碱类结构的农用化学品设计与发现提供参考。

关键词：海藻糖酶海藻糖酶抑制剂胡椒碱类化合物农用生物活性合理设计

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海藻糖酶抑制剂——一种新型农药先导结构

生命的化学 2005年第3期25卷 196-198页

作者：杨艳陈玲玲曾宪垠张红雨四川农业大学生命理学院同位素应用研究室山东理工大学山东省生物信息工程技术研究中心淄博255049 山东理工大学山东省生物信息工程技术研究中心

海藻糖是细菌、真菌以及许多无脊椎动物主要的能源供应物质之一,它可以被海藻糖酶水解成为两分子葡萄糖单体,进而参与氧化供能。因此,海藻糖酶可以作为创新农药的作用靶点。该文扼要介绍了几种海藻糖酶抑制剂,讨论了它们的结构-活性关系... 详细信息

海藻糖是细菌、真菌以及许多无脊椎动物主要的能源供应物质之一,它可以被海藻糖酶水解成为两分子葡萄糖单体,进而参与氧化供能。因此,海藻糖酶可以作为创新农药的作用靶点。该文扼要介绍了几种海藻糖酶抑制剂,讨论了它们的结构-活性关系,以期对研发新型海藻糖酶抑制剂有所帮助。

关键词：海藻糖海藻糖酶海藻糖酶抑制剂假二糖

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杓兰果胶杆菌海藻糖酶的克隆表达及应用

生物工程学报 2022年第12期38卷 4658-4668页

作者：高涵龚劲松汪子凯苏畅许正宏史劲松江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生命科学与健康工程学院江苏无锡214122 江南大学生物工程学院粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡214122

海藻糖酶在工业发酵和食品医药等领域应用广泛,我国缺乏性能优良工业品种的海藻糖酶,同时在应用研究领域还不够深入。本研究从自然界筛选获得一株产酸性海藻糖酶的杓兰果胶杆菌(Pectobacterium cypripedii),克隆获得其海藻糖酶基因PCTre... 详细信息

海藻糖酶在工业发酵和食品医药等领域应用广泛,我国缺乏性能优良工业品种的海藻糖酶,同时在应用研究领域还不够深入。本研究从自然界筛选获得一株产酸性海藻糖酶的杓兰果胶杆菌(Pectobacterium cypripedii),克隆获得其海藻糖酶基因PCTre,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)体系中实现了重组表达,在5 L发酵罐上28 h产酶达到4130 U/mL。酶学性质研究显示,PCTre能特异性水解海藻糖,最适反应温度和pH分别是35℃和5.5,在pH 4.0、4.5、5.0处理8 h后残余酶活仍超过80%,表现出良好的耐酸性。同时该酶还显示出优良的有机溶剂耐受性,在20%(V/V)乙醇溶液中处理24h仍能保留60%的酶活。进一步在含有20%(V/V)乙醇和7.5%海藻糖的模拟发酵体系中,当添加500 U/L PCTre,可在16 h内完全水解海藻糖,具有良好的应用于工业乙醇发酵的潜力。

关键词：海藻糖酶海藻糖杓兰果胶杆菌乙醇耐受性

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海藻糖酶应用于谷氨酸发酵的研究

中国调味品 2018年第11期43卷 85-88页

作者：丛泽峰彭超张宇王林丛琦林陈美君中粮生化能源(龙江)有限公司黑龙江齐齐哈尔161100 潍坊医学院山东潍坊261042 山东师范大学生命科学学院济南250014

在温敏型谷氨酸发酵生产过程中,需要消耗大量的葡萄糖供菌体生长利用,代谢过程中逐步积累的海藻糖不能被菌体消耗利用,造成发酵成本浪费。为了进一步提高谷氨酸发酵的收率及降低生产成本,通过进行发酵工艺优化,在发酵后期27~28h加入海... 详细信息

在温敏型谷氨酸发酵生产过程中,需要消耗大量的葡萄糖供菌体生长利用,代谢过程中逐步积累的海藻糖不能被菌体消耗利用,造成发酵成本浪费。为了进一步提高谷氨酸发酵的收率及降低生产成本,通过进行发酵工艺优化,在发酵后期27~28h加入海藻糖酶将海藻糖转化成葡萄糖,供谷氨酸菌体二次利用。经过工艺优化,发酵后期添加海藻糖酶后,发酵产酸17.6g/L,产酸提高了0.6%左右,发酵糖酸转化率提高0.9%左右,温敏型谷氨酸发酵的综合水平有所提高。

关键词：温敏型谷氨酸发酵海藻糖海藻糖酶工艺优化产酸率转化率

结膜吸吮线虫海藻糖酶筛选及其生物信息学分析

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中国血吸虫病防治杂志 2020年第1期32卷 60-68页

作者：郑明辉叶昌林李先春王莉君沈玉娟徐德林遵义医科大学遵义563003 贵州省教育厅基因检测与治疗特色重点实验室中国疾病预防控制中心贵州省遵义市公安局新蒲分局

目的筛选结膜吸吮线虫基因组注释数据,鉴定海藻糖酶基因,并研究其编码蛋白的生物学特性。方法基于结膜吸吮线虫基因组筛选出海藻糖酶基因并进行PCR验证,通过生物信息学方法分析该基因编码蛋白的结构特征,包括疏水区、跨膜区、信号肽及... 详细信息

目的筛选结膜吸吮线虫基因组注释数据,鉴定海藻糖酶基因,并研究其编码蛋白的生物学特性。方法基于结膜吸吮线虫基因组筛选出海藻糖酶基因并进行PCR验证,通过生物信息学方法分析该基因编码蛋白的结构特征,包括疏水区、跨膜区、信号肽及结构域,以及编码蛋白质的二级、三级结构及其抗原表位。对其编码的氨基酸序列进行同源比对,利用MEGA X软件构建系统发育树,通过STRING数据库对其蛋白互作网络进行预测。结果从结膜吸吮线虫基因组中筛选鉴定出1条具有完整编码区的海藻糖酶基因序列,其长度为1638 bp,编码545个氨基酸;预测其编码蛋白大小为63478.48 ku,为分泌蛋白;其5′区域包含一个信号肽,无跨膜区,推测具有7个抗原表位。以STRING数据库中线虫蛋白互作网络信息为参考,对结膜吸吮线虫海藻糖酶基因的蛋白质互作网络进行预测,共鉴定出包括10个基因在内的27个互作关系。结论从结膜吸吮线虫基因组中筛选出1条海藻糖酶基因并对其编码蛋白进行了生物信息学分析,从而为该蛋白的生物学功能研究及结膜吸吮线虫病疫苗候选分子筛选奠定了基础。

关键词：结膜吸吮线虫基因组海藻糖酶生物信息分析

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家蚕微孢子虫海藻糖酶3的表达、定位及功能

昆虫学报 2020年第6期63卷 727-734页

作者：张轶岭李俊昊宁嘉兴 Bismark KYEI 沈中元江苏科技大学生物技术学院江苏镇江212018

【目的】本研究旨在初步明确家蚕微孢子虫Nosema bombycis海藻糖酶3(NbTre3)的功能,为家蚕Bombyx mori微粒子病的防治提供理论依据和线索。【方法】通过PCR扩增NbTre 3,构建原核表达载体pET28a-NbTre 3;经IPTG诱导在大肠杆菌Escherichia... 详细信息

【目的】本研究旨在初步明确家蚕微孢子虫Nosema bombycis海藻糖酶3(NbTre3)的功能,为家蚕Bombyx mori微粒子病的防治提供理论依据和线索。【方法】通过PCR扩增NbTre 3,构建原核表达载体pET28a-NbTre 3;经IPTG诱导在大肠杆菌Escherichia coli中表达重组蛋白NbTre3,Western blot检测目的蛋白;Ni柱亲和层析法对重组蛋白NbTre3进行纯化,用获得的NbTre3免疫新西兰兔制备多克隆抗体;利用间接免疫荧光技术对成熟家蚕微孢子虫中的NbTre3进行定位;qRT-PCR检测家蚕微孢子虫感染家蚕5龄起蚕后不同时间中肠中NbTre 3的转录水平;通过分别注射siRNA-1,siRNA-2和siRNA-3进行RNAi,qRT-PCR检测RNAi后不同时间感染家蚕微孢子虫的家蚕5龄起蚕中肠中NbTre 3和16S rRNA的转录水平。【结果】成功纯化并获得重组目的蛋白NbTre3,大小约为34 kD。免疫新西兰兔后,收集血清,纯化获得NbTre3多克隆抗体,经Western blot鉴定正确。间接免疫荧光结果显示NbTre3主要分布在成熟家蚕微孢子虫孢原质中。qRT-PCR结果表明,家蚕微孢子虫感染后6 h时家蚕5龄起蚕中肠中NbTre3的表达量最高;siRNA抑制NbTre 3的表达后,家蚕微孢子虫16S rRNA的转录水平没有明显的变化。【结论】结果提示NbTre3可能在家蚕微孢子虫感染初期的发芽过程中发挥重要的作用。

关键词：家蚕微孢子虫海藻糖酶原核表达 RNA干扰 qRT-PCR