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微流控芯片上同工酶的孵育及活性检测

高等学校化学学报 2006年第7期27卷 1223-1226页

作者：刘菁庄贵生贾春平金庆辉王惠民赵建龙杨梦苏中国科学院上海微系统与信息技术研究所南通大学附属医院南通226001

建立了一种在微流控芯片上进行同工酶孵育及活性检测的方法.该方法在集成温控装置的微流控芯片上实现对同工酶与辅酶反应进程的控制,完成同工酶的进样、孵育反应、电泳分离和活性检测的实验步骤.建立了基于微流控芯片的同工酶荧光检测系... 详细信息

建立了一种在微流控芯片上进行同工酶孵育及活性检测的方法.该方法在集成温控装置的微流控芯片上实现对同工酶与辅酶反应进程的控制,完成同工酶的进样、孵育反应、电泳分离和活性检测的实验步骤.建立了基于微流控芯片的同工酶荧光检测系统,使用360 nm光源激发辅酶产生荧光,在460 nm处选择性采集荧光信号.在微流控芯片上实现了同工酶样品的快速活性检测,酶活性检测限达到0.5 U/L.

关键词：微流控芯片温控同工酶活性检测

猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

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生物工程学报 2008年第2期24卷 214-219页

作者：郑兰兰贾云飞崔保安陈红英魏战勇陈瑞亮河南农业大学牧医工程学院

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA,克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T-IL18,转化*** JM109感受态细胞,取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明,pIL-18成熟... 详细信息

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA,克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T-IL18,转化*** JM109感受态细胞,取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明,pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp,编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中,构建重组质粒pGEX-IL18,转化*** BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白,占菌体总蛋白的28%左右,以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤,用MTT法测定表明,重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。

关键词：猪白细胞介素18 成熟蛋白原核表达活性检测

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轻链淀粉样蛋白的包涵体表达及体外活性检测

中国医药工业杂志 2022年第7期53卷 977-985页

作者：李茜边延林朱建伟张宝红上海交通大学药学院细胞工程及抗体药物教育部工程研究中心上海200240

该研究通过构建大肠埃希菌原核表达载体、优化诱导条件,从包涵体中获得了轻链淀粉样蛋白AL-09及V6wil可变结构域;后续采用硫磺素T(ThT)法检测了其在体外的聚集活性,并利用MTT法初步鉴定了其对心肌细胞AC16的细胞毒性。结果表明,AL-09及V... 详细信息

该研究通过构建大肠埃希菌原核表达载体、优化诱导条件,从包涵体中获得了轻链淀粉样蛋白AL-09及V6wil可变结构域;后续采用硫磺素T(ThT)法检测了其在体外的聚集活性,并利用MTT法初步鉴定了其对心肌细胞AC16的细胞毒性。结果表明,AL-09及V6wil的最适异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导浓度分别为0.2和0.4 mmol/L,最佳诱导时间均为3 h,蛋白总产量可达约10 mg/L;2种轻链淀粉样蛋白均具备体外纤维化活性,且在心肌细胞AC16中均表现出显著的细胞毒性。该研究建立了轻链淀粉样蛋白的包涵体表达系统,为轻链淀粉样变性的深入研究及新型疗法开发提供了一定的研究基础。

关键词：轻链淀粉样蛋白大肠埃希菌包涵体表达活性检测

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草鱼肾中性粒细胞的分离鉴定与活性检测

中国水产科学 2021年第12期28卷 1515-1522页

作者：常藕琴霍礼霞罗满林石存斌张德峰潘厚军任燕中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室华南农业大学

分离纯化草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾中性粒细胞、鉴定和检测其活性,目的在于为研究中性粒细胞的功能和免疫防御机制提供细胞材料。本研究使用鱼类脏器组织中性粒细胞分离试剂盒和差异贴壁法分离获得草鱼肾中性粒细胞;应用迪夫氏... 详细信息

分离纯化草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾中性粒细胞、鉴定和检测其活性,目的在于为研究中性粒细胞的功能和免疫防御机制提供细胞材料。本研究使用鱼类脏器组织中性粒细胞分离试剂盒和差异贴壁法分离获得草鱼肾中性粒细胞;应用迪夫氏染色、碘化钾-吡啰红G (KI-Py G)染色、电镜技术鉴定细胞形态,使用多功能酶标仪检测经MPA刺激的细胞活性,台盼蓝染色法和CCK-8检测细胞存活率。结果显示,获得的细胞大小均一,细胞核圆形或肾形,胞质有A、B型颗粒,表面有皱褶,具有中性粒细胞的形态特征;细胞纯度达(99.3±0.53)%,细胞活力达(97.70±0.76)%,在体外培养24h内细胞存活率可保持在(89.91±3.56)%;在PMA刺激下检测到细胞表达MPO、ROS、NO和NETs的量显著提高(P<0.05),与刺激时间呈正相关。结果证实,分离的细胞具有很好的活力,具有中性粒细胞的功能特征。本研究成功建立草鱼中性粒细胞的分离方法,细胞具有很好的活力,可为深入研究鱼类中性粒细胞的功能和免疫机制提供基础。

关键词：草鱼中性粒细胞分离鉴定活性检测

Cbl-b蛋白的重组表达、纯化和活性检测方法的建立

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基因组学与应用生物学 2019年第7期38卷 2981-2989页

作者：张彤晖胡有天吴方上海交通大学系统生物医学研究院系统生物医学教育部重点实验室

Cbl-b是一种重要的泛素连接酶E3酶,负责与多种底物蛋白的特异识别,并因此介导特定蛋白的降解。研究表明,Cbl-b缺失可激活自然杀伤细胞,从而阻止肿瘤的扩散转移,因此Cbl-b被认为是一种肿瘤免疫治疗的新靶点。但目前针对Cbl-b蛋白的生化... 详细信息

Cbl-b是一种重要的泛素连接酶E3酶,负责与多种底物蛋白的特异识别,并因此介导特定蛋白的降解。研究表明,Cbl-b缺失可激活自然杀伤细胞,从而阻止肿瘤的扩散转移,因此Cbl-b被认为是一种肿瘤免疫治疗的新靶点。但目前针对Cbl-b蛋白的生化性质以及体外活力测定方法研究较少。本研究构建了Cbl-b不同结构域的重组表达载体。通过对其表达和纯化条件进行优化,确定了Cbl-b的底物结合功能域的最优表达条件,即使用感受态BL21(DE3),在IPTG浓度为0.5 mmol/L、温度25℃下诱导10 h。利用亲和柱和分子筛层析联用纯化方法,提纯得到大小为65 kD的GST-Cbl-b(39~368)重组蛋白,其纯度可达95%。进一步,通过药物设计方法,设计并合成带有荧光素标记的Cbl-b底物Cblin-FAM,并利用配体结合实验验证了Cbl-b(39~368)结合底物的活力。本研究得到了具有活力的Cbl-b底物结合功能域并建立了其体外表达纯化方法,为后续发展基于Cbl-b纯酶的体外泛素化检测方法,以及发展新型、特异靶向Cbl-bE3酶的调控物提供了物质基础。

关键词： Cbl-b Cblin E3酶活性检测蛋白质纯化

rAAV2／1-Acrp30病毒的纯化、扩增与活性检测

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中华微生物学和免疫学杂志 2009年第7期29卷 618-622页

作者：李强翔钟惠菊欧阳石谭华清王敏龙国祥李果中南大学湘雅医院长沙410008 湖南省娄底市中心医院 417000 中南大学行政管理学院长沙410083 解放军458医院

目的将大鼠脂联素基因（Acrp30）克隆到腺相关病毒（AAV）载体中，经包装、纯化、扩增后获得rAAV2／1-Acrp30病毒，并进行活性检测。方法筛选阳性克隆获得pSNAV2．0-Acrp30，EcoRⅠ／SalⅠ双酶切鉴定，并行测序。转染BHK21细胞，G418筛... 详细信息

目的将大鼠脂联素基因（Acrp30）克隆到腺相关病毒（AAV）载体中，经包装、纯化、扩增后获得rAAV2／1-Acrp30病毒，并进行活性检测。方法筛选阳性克隆获得pSNAV2．0-Acrp30，EcoRⅠ／SalⅠ双酶切鉴定，并行测序。转染BHK21细胞，G418筛选培养，获得抗药克隆细胞株。HSV1-rc／△UL2感染，包装此细胞株并收获病毒载体rAAV2／1-Acrp30。行DNA斑点杂交法测定病毒滴度，SDS-PAGE分析判断病毒纯度，Western blot法检测目的蛋白脂联素在HEK293细胞中的表达活性。结果PCR电泳及酶切鉴定表明，pSNAV2．0-Acrp30重组成功，基因测序显示装入pSNAV2．0质粒中的Acrp30基因正确。rAAV2／1-Acrp30病毒的大致滴度为1．0×10^12μg／ml，HEK293细胞分泌蛋白浓度为50ng／ml，病毒载体纯度在95％以上。结论实验获得的脂联素病毒载体滴度高、感染性好，可试用于GK（Cow—Kakizaki）大鼠脂联素转基因治疗。

关键词： rAAV2/1-Acrp30 扩增活性检测

抗HIV-1 gp41单链抗体导向SEAD227A融合蛋白原核温控表达及活性检测

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中华微生物学和免疫学杂志 2004年第8期24卷 653-657页

作者：王宏金宁一徐一鸣金洪涛张立树江文正中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所

目的　获得抗HIV 1gp4 1单链抗体与葡萄球菌外毒素A融合表达的重组导向毒素蛋白。方法　人工合成能广泛识别HIV 1gp4 1的单链抗体 (ScFv4 1)基因和金黄色葡萄球菌外毒素A(SEA)基因 ,将SEA基因第 2 2 7位编码Asp(D)的密码子GAT转换成编码... 详细信息

目的　获得抗HIV 1gp4 1单链抗体与葡萄球菌外毒素A融合表达的重组导向毒素蛋白。方法　人工合成能广泛识别HIV 1gp4 1的单链抗体 (ScFv4 1)基因和金黄色葡萄球菌外毒素A(SEA)基因 ,将SEA基因第 2 2 7位编码Asp(D)的密码子GAT转换成编码Ala(A)的密码子GCT ,并对两基因进行密码子优化。以大肠杆菌温控型表达质粒pBV2 2 0为载体 ,分别构建单表达ScFv4 1的质粒pBV 4 1和SEA与ScFv4 1融合表达的质粒pBV SL4 1,转化大肠杆菌感受态细胞 ,通过提高温度诱导表达 ,表达产物经分子筛层析折叠复性后 ,检测单链抗体结合活性及重组导向毒素介导的细胞毒淋巴细胞 (CTL)杀伤活性。结果　表达质粒pBV 4 1和pBV SL4 1分别在E .coliBL2 1(DE3)plys中 4 4℃诱导 6h、4 2℃诱导 7h得到较高表达 ,经SDS PAGE、薄层扫描分析表明 ,目的蛋白分别占菌体总蛋白的14 .35 9%和 2 3.4 82 % ,目的蛋白经复性后可与HIV 1抗原条发生良好的结合反应 ,并且SL4 1可激活外周血淋巴细胞 (PBMC)并介导其杀伤稳定表达HIV 1gp16 0蛋白的靶细胞。结论　成功得到ScFv4 1与SEA融合表达蛋白SL4 1,为研制抗HIV 1重组导向毒素奠定基础。

关键词：抗HIV-1gp41单链抗体 SEAD227A融合蛋白原核温控表达活性检测金黄色葡萄球菌外毒素A 淋巴细胞

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酵母表面展示分选酶底物用于分选酶活性检测

微生物学报 2009年第11期49卷 1534-1539页

作者：罗立新吴琳林影华南理工大学生物科学与工程学院广州510006

【目的】以EGFP标签检测分选酶底物QALPETGEE在毕赤酵母表面的表达,然后将酵母表面展示的底物与分选酶相互作用以检测分选酶活性。【方法】以pcDNA-myc-his-EGFP为模板,通过PCR技术将QALPETGEE-linker-EGFP基因连接到穿梭载体pKFS上,构... 详细信息

【目的】以EGFP标签检测分选酶底物QALPETGEE在毕赤酵母表面的表达,然后将酵母表面展示的底物与分选酶相互作用以检测分选酶活性。【方法】以pcDNA-myc-his-EGFP为模板,通过PCR技术将QALPETGEE-linker-EGFP基因连接到穿梭载体pKFS上,构建QALPETGEE-linker-EGFP酵母表面展示载体后转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中。重组菌经培养,利用荧光显微镜检测重组酵母的荧光强度,然后通过荧光分光光度计检测分选酶与底物相互作用后产生游离的EGFP荧光强度进而确定分选酶的酶活。【结果】荧光显微镜下观察到重组酵母细胞表面有绿色荧光且强度随时间增强。荧光分光光度计检测表明,反应后上清游离的EGFP荧光强度由原先的187.67±2.16增加至273.47±2.14。【结论】这表明分选酶底物已成功展示在酵母表面,且为分选酶的活性检测提供了高效、经济的方法。

关键词：酵母展示技术分选酶荧光分光光度计底物活性检测

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重组人溶菌酶活性检测方法研究

中国新药杂志 2019年第9期28卷 1070-1074页

作者：李晓颖高恩杨金芳李敏杨小琳赵金礼陕西慧康生物科技有限责任公司西安710054

目的:本研究旨在以分光光度法为基础,建立重组人溶菌酶原料药和重组人溶菌酶滴眼液的活性检测方法,并对其进行方法学研究。用于重组人溶菌酶原料药和滴眼液的质量控制。方法:依据卫生部药品标准,采用分光光度法,对重组人溶菌酶活性检测... 详细信息

目的:本研究旨在以分光光度法为基础,建立重组人溶菌酶原料药和重组人溶菌酶滴眼液的活性检测方法,并对其进行方法学研究。用于重组人溶菌酶原料药和滴眼液的质量控制。方法:依据卫生部药品标准,采用分光光度法,对重组人溶菌酶活性检测方法的专属性、耐用性、精密度、线性范围以及准确性进行了验证。通过对重组人溶菌酶滴眼液进行同一时间不同样品不同底物,不同时间不同样品不同底物活性测定,确定重组人溶菌酶滴眼液的活性范围。结果:实验结果显示该活性检测方法专属性、耐用性、重复性、中间精密度、线性、准确度均良好。48 h耐用性(标准偏差为1 394. 4,RSD%为0. 95%);重复性(标准偏差为1 472. 0,RSD%为0. 99%),中间精密度(标准偏差1 000. 0,RSD%为0. 68%);检测下限为0. 625μg·m L^(-1),在5～25μg·m L^(-1)浓度范围内线性(标准曲线为y=0. 007 7x+0. 068 5,R^2=0. 991 1);准确性(回收率100. 7%～109. 6%,标准偏差为0. 032 2,RSD%为3. 05%);连续3批重组人溶菌酶原料活性分别为152 500,153 500和150 800 U·mg^(-1); 3批重组人溶菌酶滴眼液活性分别为142 000,140 000和133 000 U·mg^(-1)。连续3批重组人溶菌酶冻干粉和3批重组人溶菌酶滴眼液活性均稳定。结论:本方法可用于重组人溶菌酶原料药及重组人溶菌酶滴眼液的生物学活性测定。

关键词：重组人溶菌酶活性检测方法验证