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气肿疽梭菌NanA基因核酸疫苗的免疫效果评价

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动物医学进展 2019年第12期40卷 68-73页

作者：陈竞张皓马玉腾于成东齐强金鑫延边大学农学院吉林延吉133000 延边大学珲春校区吉林珲春133300

为了检测气肿疽梭菌NanA基因核酸疫苗的免疫效果,在成功构建pVAX1-NanA真核表达重组质粒的基础上将其转染至Vero细胞,通过间接免疫荧光鉴定其表达,并将成功构建的pVAX1-NanA质粒大量提取后免疫Balb/c小鼠,设置pVAX1-NanA核酸疫苗组、pV... 详细信息

为了检测气肿疽梭菌NanA基因核酸疫苗的免疫效果,在成功构建pVAX1-NanA真核表达重组质粒的基础上将其转染至Vero细胞,通过间接免疫荧光鉴定其表达,并将成功构建的pVAX1-NanA质粒大量提取后免疫Balb/c小鼠,设置pVAX1-NanA核酸疫苗组、pVAX1空载体组和PBS对照组。对小鼠采血并分离血清,用ELISA测定血清中的IgG、IgG1、IgG2a抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平;第3次免疫2周后,用流式细胞仪测定小鼠脾脏中的CD4^+和CD8^+T细胞水平。结果表明,pVAX1-NanA核酸疫苗免疫Balb/c小鼠后,小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a的抗体水平极显著高于pVAX1空载体组和PBS对照组(P0.05)。试验成功制备了pVAX1-NanA核酸疫苗,且pVAX1-NanA核酸疫苗可刺激Balb/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫。

关键词：气肿疽梭菌 NanA基因核酸疫苗免疫原性

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气肿疽梭菌不同靶基因检测方法的比较

江苏农业科学 2015年第11期43卷 278-280页

作者：云巾宴任春宇车达金清洙段雪岩司唯金鑫延边大学农学院动物医学系吉林延吉133002 吉林省延边州畜牧总站吉林延吉133000 吉林省延边州动物疫病预防控制中心吉林延吉133000 吉林省延吉市动物卫生监督所吉林延吉133000

为检测牛、羊等反刍动物的气肿疽梭菌,筛选出更为特异、敏感的PCR检测方法,分别以fli A(C)、nan A、cct A为靶基因进行PCR检测,并对其敏感性、特异性等方面进行比较。结果表明,以cct A为靶基因的PCR检测方法敏感性最高,最小检测DNA量为1... 详细信息

为检测牛、羊等反刍动物的气肿疽梭菌,筛选出更为特异、敏感的PCR检测方法,分别以fli A(C)、nan A、cct A为靶基因进行PCR检测,并对其敏感性、特异性等方面进行比较。结果表明,以cct A为靶基因的PCR检测方法敏感性最高,最小检测DNA量为12.30×10^(-5)pg/μL;以fli A(C)、nan A为靶基因的PCR检测方法敏感性较低,最小检测DNA量为0.123 ng/μL;3种靶基因引物菌未扩增出D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌、巴氏杆菌等基因片段,具有较好的特异性。本试验为气肿疽的快速诊断提供了更为敏感、特异的检测技术。

关键词：气肿疽梭菌 fliA(C)基因 nanA基因 cctA基因 PCR方法

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气肿疽梭菌延边样的分离鉴定

畜牧与兽医 2015年第11期47卷 109-111页

作者：云巾宴任春宇车达金清洙段雪岩司唯金鑫延边大学农学院动物医学系吉林延吉133002 延边州畜牧总站吉林延吉133000 延边州动物疫病预防控制中心吉林延吉133000 延吉市动物卫生监督所吉林延吉133000

牛、羊等反刍动物的气肿疽病是由气肿疽梭菌感染引起的严重危害畜牧业发展的一种疾病,本研究从延边州延吉市采集疑似气肿疽梭菌感染的牛肝脏、脾脏、肌肉等组织进行气肿疽梭菌的分离鉴定。结果表明:经病原学检查、生化鉴定、动物试验及... 详细信息

牛、羊等反刍动物的气肿疽病是由气肿疽梭菌感染引起的严重危害畜牧业发展的一种疾病,本研究从延边州延吉市采集疑似气肿疽梭菌感染的牛肝脏、脾脏、肌肉等组织进行气肿疽梭菌的分离鉴定。结果表明:经病原学检查、生化鉴定、动物试验及分子生物学鉴定,本试验成功对气肿疽梭菌进行了分离,该菌株细胞毒素、cct A基因与Gen Bank上已发表的气肿疽梭菌ATCC 10092菌株的同源性达到99.0%,此结果为该地区气肿疽病的免疫和微生态防治提供了重要的参考依据。

关键词：延边地区气肿疽梭菌分离鉴定

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气肿疽梭菌CctA基因的真核表达

动物医学进展 2018年第12期39卷 72-75页

作者：陈竞齐强罗永仁张皓李成辉任春宇车达姜永越于建华金鑫延边大学农学院吉林延吉133000 珲春边境经济合作区综合服务站吉林珲春133315 延边州畜牧总站吉林延吉133000 延边州动物疫病预防控制中心吉林延吉133000 图们市农业和畜牧业局吉林图们133000

为了控制延边地区气肿疽病的发病率,制备出有效的核酸疫苗,根据NCBI上气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)的基因序列设计出一对特异性引物。将PCR扩增的CctA基因克隆到pMD19-Tsimple载体,对测序正确的基因进行序列分析,再次克隆至pcDNA3.1-1真... 详细信息

为了控制延边地区气肿疽病的发病率,制备出有效的核酸疫苗,根据NCBI上气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)的基因序列设计出一对特异性引物。将PCR扩增的CctA基因克隆到pMD19-Tsimple载体,对测序正确的基因进行序列分析,再次克隆至pcDNA3.1-1真核表达载体,并且将其转染Vero细胞。结果表明,pcDNA3.1-CctA组通过转染后的细胞存在绿色荧光的现象,同时pcDNA3.1-CctA重组质粒表达的产物大小约19ku,说明Vero细胞中的pcDNA3.1-CctA质粒成功表达了CctA蛋白。

关键词：气肿疽梭菌 CctA基因真核表达载体

气肿疽梭菌CctA基因真核表达载体的构建与鉴定

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黑龙江畜牧兽医 2018年第5期 142-144页

作者：张皓段雪岩张永佳车达邓文学李成辉关如婷金鑫延边大学农学院中国农业大学延边州动物疫病预防控制中心临沂市农业学校

为了构建气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)基因真核表达载体,探讨制备安全有效气肿疽核酸疫苗的可行性,试验根据NCBI上气肿疽CctA基因序列,通过Primer Premier 5.0设计了1对特异性引物用于基因扩增,将PCR扩增的CctA基因克隆至pMD19-T载体构建... 详细信息

为了构建气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)基因真核表达载体,探讨制备安全有效气肿疽核酸疫苗的可行性,试验根据NCBI上气肿疽CctA基因序列,通过Primer Premier 5.0设计了1对特异性引物用于基因扩增,将PCR扩增的CctA基因克隆至pMD19-T载体构建重组质粒pMD19-T-CctA,对测序正确的基因进行序列分析后亚克隆至pVAX-1真核表达载体,并对构建的pVAX1-CctA真核表达质粒进行PCR和双酶切鉴定。结果表明:成功扩增了CctA基因目的片段,并获得了与预期大小相符的重组质粒pMD19-T-CctA和真核表达质粒pVAX1-CctA。说明试验成功构建了气肿疽CctA基因真核表达载体。

关键词：气肿疽梭菌 CctA基因真核表达载体构建鉴定

气肿疽梭菌NanA基因真核表达载体的构建及小鼠免疫初探

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气肿疽梭菌NanA基因真核表达载体的构建及小鼠免疫初探

作者：张皓延边大学

学位级别：硕士

气肿疽(Clostridium chauvoei)是一种急性、热性、败血性传染病,主要感染反刍动物,其典型症状为发病动物肌肉丰满部位发生炎性、气性肿胀,触压有捻发音,患部皮肤干硬易形成坏疽,食欲减退,呼吸困难。该病的流行有一定的地域性和季节性,... 详细信息

气肿疽(Clostridium chauvoei)是一种急性、热性、败血性传染病,主要感染反刍动物,其典型症状为发病动物肌肉丰满部位发生炎性、气性肿胀,触压有捻发音,患部皮肤干硬易形成坏疽,食欲减退,呼吸困难。该病的流行有一定的地域性和季节性,在天气炎热的多雨季节多发生于潮湿的山谷、牧场。近年来常有爆发气肿疽的报道,为畜牧业和养殖业的发展带来了巨大的冲击,同时也逐渐地威胁到人类的健康和经济。为了制备安全有效的气肿疽核酸疫苗,有效控制该病的发生,本研究根据GenBank中已发表的气肿疽梭菌NanA基因序列,设计合成了一对特异性引物,以气肿疽梭菌总DNA为模板,扩增出NanA目的基因并克隆至pMD 18-T simple载体,对测序正确的NanA基因进行分析。将克隆质粒pMD 18-T-NanA进行双酶切后,与pVAX1真核表达载体连接,成功构建p VAX 1-NanA真核表达重组质粒并将其转染至Vero细胞,通过间接免疫荧光鉴定其表达。将成功构建的pVAX1-NanA质粒大量提取后免疫BALB/c小鼠,设置pVAX1-NanA核酸疫苗组、pVAX1空载体组和PBS对照组。对小鼠进行采血并分离血清,通过ELISA法测定血清中的IgG,IgG1、IgG2a抗体水平和IFN-y、IL-4细胞因子水平。第三次免疫2周后,通过流式细胞仪测定小鼠脾脏淋巴细胞中的CD4+和CD8+水平。通过对小鼠的抗体水平、细胞因子水平和T细胞亚群含量检测,综合评价小鼠的体液免疫和细胞免疫水平。研究结果表明:本试验成功扩增了气肿疽梭菌NanA基因,片段大小为1950bp,与参考序列相比,共存在3处核苷酸突变,核苷酸与氨基酸序列的同源性均为99.8%。该蛋白三级结构以β-折叠和无规则卷曲为主,蛋白表面有多个抗原表位区域。pVAX1-NanA核酸疫苗接种BALB/c小鼠后,其血清中IgG、IgG1和IgG2a的抗体水平显著高于pVAX1空载体组和PBS对照组(P气肿疽梭菌 NanA基因核酸疫苗的研发奠定了一定的基础。

关键词：气肿疽梭菌 NanA基因真核表达免疫学

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气肿疽梭菌毒素的研究

中国畜禽传染病 1991年第2期13卷 46-48,43页

作者：马贵平北京动植物检疫所

菌株 C_(54)-1在牛肉肝蛋白胨汤中培养,产生的毒素对小白鼠的毒力是在厌气肉肝汤中培养时的10倍.平皿扩散、层析过滤等方法对毒素作定性和定量的分析,证实α、β、γ、δ四种毒素均存在;证明α毒素可分为三种组分;还分离出一种称为ε的... 详细信息

菌株 C_(54)-1在牛肉肝蛋白胨汤中培养,产生的毒素对小白鼠的毒力是在厌气肉肝汤中培养时的10倍.平皿扩散、层析过滤等方法对毒素作定性和定量的分析,证实α、β、γ、δ四种毒素均存在;证明α毒素可分为三种组分;还分离出一种称为ε的新溶血素。明确了毒素毒力和溶血性的关系.试验表明,类毒素免疫,豚鼠能抵抗全培养物的攻毒;体内外抗毒素都能中和毒素的致死性;IgG 是主要的保护抗体.

关键词：气肿疽梭菌毒素鉴定分离

气肿疽梭菌PCR-ELISA检测方法的建立

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气肿疽梭菌PCR-ELISA检测方法的建立

作者：方程延边大学

学位级别：硕士

气肿疽是由气肿疽梭菌（Clostridium chauvoei）引起的,主要感染牛、羊等反刍动物的一种急性、热性、败血性和高致死性传染病。病原体易对受损动物机体侵袭,芽孢由咽喉或口腔向血液或受伤组织入侵。临床证实,死亡率与年龄具有相关性,年... 详细信息

气肿疽是由气肿疽梭菌（Clostridium chauvoei）引起的,主要感染牛、羊等反刍动物的一种急性、热性、败血性和高致死性传染病。病原体易对受损动物机体侵袭,芽孢由咽喉或口腔向血液或受伤组织入侵。临床证实,死亡率与年龄具有相关性,年龄越大,感染率及病死率相对越低,且地方性流行特征明显。若没有进行针对性干预,会增加疾病死亡率,养殖户营业额下降。气肿疽前期症状隐匿,是一种高死亡率、低治愈率传染病,临床防控难度较大,不利于畜牧业正常发展,进而对人类生命健康产生威胁,当前在世界范围内引起高度重视。因此,本试验建立了一种对于气肿疽梭菌的流行病学调查和诊断的简便、特异、敏感的气肿疽梭菌PCR-ELISA检测方法。本试验依据GenBank上发布的气肿疽梭菌NagH基因序列（登录号KY064176.1）应用Primer Premier软件设计合成两对特异性引物,并在其中一对引物的上、下游5’端分别标记非放射性引物生物素（Bio）和地高辛（Dig）。将气肿疽梭菌阳性样本作为研究对象,对基因组DNA提取后PCR扩增,目的基因片段获取后纯化回收。将其向pMD-19T simple载体克隆,质粒PCR后双酶切,将取得的阳性结果送至生物公司检验。优化PCR产物稀释度、封闭时间、链酶亲和素浓度、PCR产物稀释度、HRP-抗地高辛抗体显色时间及稀释度,选择最合适反应条件,依据PCR-ELISA步骤操作。选取经PCR检测后35份呈阴性气肿疽梭菌样本,对其进行PCR-ELISA检测,对OD470nm值测定,对气肿疽梭菌病PCR-ELISA临界值计算,选择更准确判断标准。接下来倍比稀释气肿疽梭菌基因组DNA,应用PCR-ELISA法检测,对其敏感性确定。选择合适反应条件,将巴氏杆菌、腐败梭菌、D型及E型产气荚膜梭菌基因组DNA作为反应模版,对PCR-ELISA法检测特异性判断。将150份待检牛抗凝血样本作为研究对象,分别检测不同时间及相同时间下包被酶标板重复性试验稳定性,另外对比常规法与该检测方法检测稳定性,探究该检测方法应用可行性。结果表明,常规PCR检测后条带大小约为1 107 bp,与Genbank上发布的气肿疽梭菌基因序列[KY064176.1]的同源性达到99%,证明扩增的目的片段为气肿疽梭菌。经优化实验各个环节,得出如下结论:气肿疽梭菌阴性样本临界值为0.174,阴性是指样本OD470om值≤0.234,反之为阳性。封闭适宜时间为60 min,底物适宜显色时间为15 min,PCR产物及HRP标记抗地高辛抗体适宜稀释度分别为30倍、2 000倍,链酶亲和素适宜浓度为5 μg/mL。气肿疽梭菌DNA经PCR-ELISA法检测结果显示,其最低浓度为2.2 pg/μL。与常规PCR法检测出的220 pg/μL相比敏感性高100倍,且与D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌和巴氏杆菌等之间无交叉反应,具有较强的特异性。对150份待检牛抗凝血进行检测,阳性检出率为21.3%,高于常规PCR法的16.0%。

关键词：气肿疽梭菌 NagH基因 PCR-ELISA 检测方法

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气肿疽梭菌PCR检测方法的建立及初步应用

气肿疽梭菌PCR检测方法的建立及初步应用

作者：司唯延边大学

学位级别：硕士

气肿疽是由气肿疽梭菌引起的以牛为主的一种热性、急性、地方性传染病,以肌肉和深部组织发生气性坏疽为主要特征。该病主要经过皮肤及消化道创伤感染,往往来不及治疗就会导致病畜死亡,羊、猪、鹿甚至是人也都有相关报道显示被感染,被国... 详细信息

气肿疽是由气肿疽梭菌引起的以牛为主的一种热性、急性、地方性传染病,以肌肉和深部组织发生气性坏疽为主要特征。该病主要经过皮肤及消化道创伤感染,往往来不及治疗就会导致病畜死亡,羊、猪、鹿甚至是人也都有相关报道显示被感染,被国际兽医局评定为第三类传染病。气肿疽在0.5～3岁的黄牛及水牛多发,无明显的季节规律。气肿疽在我国的暴发,给我国的畜牧业带来了巨大的经济损失,也引起了人们的高度关注。但目前尚无有效的防控手段,因此,建立快速、敏感且特异的检测方法来诊断气肿疽病是当务之急。本试验为建立气肿疽梭菌(Clostridium chauvoei)的快速检测方法,根据GenBank中已发表的气肿疽梭菌细胞毒素cctA基因序列(登录号：JQ692583)设计了一对特异性引物,并以气肿疽梭菌标准株C54-1全基因组DNA为模板,对气肿疽梭菌cctA基因进行PCR扩增,并经过敏感性和特异性试验对该试验方法进行验证。结果显示：建立的气肿疽梭菌PCR检测方法扩增出的片段大小为501bp,与GenBank上气肿疽梭菌的同源性达99.4%,且该方法与D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌和巴氏杆菌等病原体无交叉反应,最低检测浓度为12.30 fg/μL。结果表明,建立的PCR检测方法具有快速、特异、敏感、高效等优点,与其他诊断方法相比更适用于气肿疽梭菌的诊断,为牛气肿疽病的快速检测和诊断提供基础研究。

关键词：聚合酶链式反应气肿疽梭菌 cctA基因检测方法